JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 2:58 min • July 8th, 2025
Weźmy nieruchomy fragment mózgu myszy zawierający jądro podstawne Meynerta, bogate we włókna nerwowe wyrażające enzym acetylotransferazę choliny.
Sekcja jest poddawana wstępnej obróbce w celu dezaktywacji endogennej peroksydazy.
Dodaj detergent, aby przepuszczalnie błony komórkowe, a następnie roztwór blokujący, aby zapobiec wiązaniu się nieswoistych przeciwciał.
Zastąp roztwór pierwszorzędowymi przeciwciałami, które wiążą się z acetylotransferazą choliny.
Przemyć buforem w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał. Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi znakowanymi biotyną, które wiążą się z przeciwciałami pierwszorzędowymi.
Usuń niezwiązane przeciwciała i dodaj kompleksy awidyna-biotyna-peroksydaza, które wiążą się z przeciwciałami drugorzędowymi.
Umyć, aby usunąć nadmiar kompleksów.
Dodaj chromogenny substrat, który reaguje z peroksydazą, tworząc kolorowy osad.
Spłucz wodą destylowaną, aby usunąć nadmiar osadu.
Przenieść przekrój na zżelowane szkiełko.
Następnie odwodnić sekcję za pomocą rosnących stężeń etanolu, a następnie ksylenu.
Zamontuj przekrój i obserwuj pod mikroskopem, aby uwidocznić poplamione włókna nerwowe.
W celu znakowania immunohistochemicznego skrawków tkanki, po zablokowaniu wszelkich niespecyficznych wiązań z 10% normalną surowicą bydlęcą w 0,1% Triton X-100, w soli fizjologicznej buforowanej tris, oznacz skrawki pierwszorzędowym przeciwciałem będącym przedmiotem zainteresowania, przez 48 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Pod koniec inkubacji przemyć skrawki trzy razy, przez trzy minuty, w świeżej soli fizjologicznej buforowanej trisem na przemycie. Następnie następuje inkubacja z odpowiednim biotynylowanym przeciwciałem drugorzędowym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.
Pod koniec inkubacji przemyć skrawki trzykrotnie w świeżym, tribuforowanym roztworze soli fizjologicznej, jak pokazano. Następnie barwienie kompleksem awidyna-biotyna-peroksydaza i roztworem substratu peroksydazy DAB, zgodnie z protokołami producenta.
Po umyciu zamontuj wszystkie skrawki z jednej próbki tkanki mózgowej na jednym zżelowanym szkiełku. Pozostawić próbki do wyschnięcia na powietrzu. W celu odwodnienia skrawków należy zanurzyć próbki dwa razy, na pięć minut na rozcieńczenie, w sekwencyjnych wznoszących się roztworach etanolu, jak wskazano, a następnie oczyścić je dwoma 10-minutowymi płukaniami ksylenu. Następnie za pomocą odpowiedniego medium montażowego umieść szkiełka nakrywkowe na szkiełkach.