Pomiar wychwytu dopaminy w synaptosomach mózgu myszy za pomocą dopaminy znakowanej radioaktywnie

Zbierz synaptosomy, struktury związane z błoną pochodzącą z nienaruszonych presynaptycznych zakończeń synaps neuronalnych, które zawierają transportery dopaminy (DAT), z mózgu myszy.

Napełnić probówki buforem zawierającym ligandy, a probówki referencyjne buforem zawierającym ligandy i inhibitor DAT.

Dodaj synaptosomy.

Ligandy hamują enzymy rozkładające dopaminę i inne transportery, zapobiegając degradacji dopaminy i niespecyficznemu wychwytowi.

Wprowadź nieznakowaną i znakowaną radioaktywnie dopaminę.

W warunkach testowych synaptosomalny DAT wychwytuje dopaminę.

W warunkach referencyjnych inhibitor zapobiega wychwytowi dopaminy za pośrednictwem DAT, umożliwiając jedynie wychwyt w tle.

Dodaj próbki do filtrów z mikrofibry, które zatrzymują synaptosomy.

Umyj, aby usunąć niezwiązaną dopaminę.

Przenieś filtry do probówek scyntylacyjnych.

Dodać płyn scyntylacyjny zawierający związek wrażliwy na promieniowanie .

Umieść probówki w liczniku scyntylacyjnym.

Emisje radioaktywne z dopaminy pobudzają związek do emitowania światła, które jest mierzone przez licznik.

Odejmij odniesienie od danych testowych, aby zmierzyć wychwyt synaptosomalnej dopaminy.

Na tym etapie dodaj 440 mikrolitrów buforu absorpcyjnego, liganda i kokainy do 12 wyznaczonych 1,5-mililitrowych probówek do mikrowirówek i 440 mikrolitrów buforu absorpcyjnego i liganda do 36 pozostałych 1,5-mililitrowych probówek do mikrowirówek. Oznacz 6 2-mililitrowych probówek wirówkowych jako 10, 5, 2,5, 1,25, 0,62 i 0,31. Następnie dodaj 750 mikrolitrów buforu absorpcyjnego i liganda do 5 probówek mikrowirówek o najniższej liczbie.

Następnie dodaj 1 455,4 mikrolitrów buforu wychwytowego i liganda, 14,6 mikrolitrów nieznakowanej dopaminy i 30 mikrolitrów trytiowanej dopaminy do probówki oznaczonej 10. Następnie przenieś 750 mikrolitrów mieszaniny z probówki oznaczonej 10 do probówki oznaczonej 5. Dobrze wymieszaj i przenieś 750 mikrolitrów mieszaniny z tej probówki do probówki oznaczonej 2,5. Powtórzyć to rozcieńczenie z pozostałymi probówkami.

Następnie należy wstępnie wypłukać filtry z mikrowłókna szklanego 4 mililitrami buforu absorpcyjnego po umieszczeniu ich na 12-dołkowym wiadrze filtrującym. Następnie dodaj 10 mikrolitrów zawiesiny błony synaptosomalnej do pierwszych 24 1,5-mililitrowych probówek mikrowirówkowych zawierających bufor 440 mikrolitrów. Ostrożnie wiruj i krótko odwiruj, aby upewnić się, że synaptosomy są zanurzone w buforze.

Następnie pozostaw je w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 minut. Po 10 minutach dodaj 50 mikrolitrów dopaminy o stężeniu 10 mikromolowym i 5 mikromolowym do pierwszych 2 kolumn i pozostaw je w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 5 minut z wstrząsaniem. Po 5 minutach zatrzymaj reakcję, dodając 1 mililitr lodowatego buforu absorpcyjnego. Powtórz to z 2,5 mikromola i 1,25 mikromola, a następnie z 0,62 mikromola i 0,31 mikromola.

Dodaj próbki do wstępnie przepłukanych filtrów z mikrofibry i umyj je 5 x 4 mililitry lodowatego buforu absorpcyjnego. Po dodaniu pierwszych 12 próbek do filtrów przenieś filtry do probówek scyntylacyjnych. Powtórz to z następnymi 12 próbkami. Przygotuj 3 maksymalne probówki do liczenia, umieszczając filtr z mikrofibry na dnie probówek scyntylacyjnych od 49 do 51 i dodając 25 mikrolitrów maksymalnej dopaminy 10 mikromolowych na górze.

Następnie pozostaw wszystkie 51 rurek scyntylacyjnych w dygestoriach na 1 godzinę. Następnie dodaj 3 mililitry płynu scyntylacyjnego do każdej probówki scyntylacyjnej i energicznie wstrząsaj na shakerze przez 1 godzinę. Aby policzyć trytiowaną dopaminę w liczniku beta przez 1 minutę, otwórz program i wybierz odpowiednie ustawienia. Do oznaczania białek należy użyć standardowego zestawu do oznaczania białek BCA, aby określić stężenia białek w synaptosomach w celu dostosowania i prawidłowego porównania wychwytu między próbkami.