Znakowanie interneuronów wypełnionych biocytyną w wycinkach hipokampa szczurów w celu wizualizacji

Weź utrwalone i przepuszczalne plastry hipokampa szczura zawierające interneurony wypełnione biocytyną z inaktywowanymi endogennymi peroksydazami.

Dodać kompleksy awidyna-biotyna (ABC) zawierające peroksydazę chrzanową (HRP) i inkubować, umożliwiając awidynie związanie się z biocytyną.

Zmyć niezwiązane ABC.

Dodaj mieszaninę substratu chromogenicznego i wzmacniacza metalu, a następnie inkubuj.

Wprowadź nadtlenek wodoru, aby aktywować HRP, który utlenia podłoże, tworząc ciemny osad, podczas gdy wzmacniacz poprawia kontrast.

Przenieś plastry na bibułę filtracyjną i usuń nadmiar buforu. Potraktuj tetratlenkiem osmu, aby zwiększyć kontrast.

Umieść plastry na szkiełku i zamontuj. Odwodnić je, zwiększając stężenie etanolu.

Umyj plastry w absolutnym etanolu i tlenku propylenu.

Dodaj żywicę, aby nacieknąć tkanki.

Umieść plastry w planszecie i podgrzej, aby spolimeryzować żywicę. Przenieś plastry na szkiełko, umieść szkiełko nakrywkowe i zestal żywicę.

Za pomocą mikroskopii świetlnej wizualizuj ciemno zabarwione interneurony wypełnione biocytyną.

Umieścić skrawki w czystej szklanej fiolce zawierającej PBS. Przeprowadź reakcję HRP awidyny, najpierw inkubując skrawki w kompleksie biotyny awidyny lub ABC przez co najmniej dwie godziny w celu amplifikacji produktu reakcji HRP.

Następnie przemyj skrawki PBS 3 razy przez 10 minut, a następnie dwukrotnie buforem Tris przez 10 minut. Po usunięciu ostatniego śladowego płukania buforu, szybko dodaj 1 kroplę 8% roztworu chlorku niklu do roztworu diaminobenzydyny lub roztworu DAB. Następnie odpipetować roztwór i odpipetować go do wymieszania.

I szybko dodaj 1 mililitr tego roztworu na sekcje. Inkubuj sekcje w tym roztworze przez 15 minut. Następnie dodaj 10 mikrolitrów 1% nadtlenku wodoru do roztworu DAB. Pozwól, aby reakcja przebiegała w ciemności pod ciągłym wzburzeniem przez około 1 do 2 minut, aż komórki zostaną oznaczone.

W dygestorium umieścić mały okrąg bibuły filtracyjnej na szalce Petriego i zwilżyć go PB. Podnieś skrawki pojedynczo ze szklanej fiolki za pomocą pędzla i ostrożnie ułóż je płasko na papierze. Przykryj sekcje kolejnym zwilżonym kółkiem bibuły filtracyjnej. I usuń nadmiar bufora, delikatnie dotykając bibuły do powierzchni.

Nałóż 8 lub 9 kropli 1% tetratlenku osmu w PB na górny papier. Przykryj naczynie i trzymaj w dygestoriach przez co najmniej 30 minut, ale nie dłużej niż godzinę. Po spłukaniu, zamontowaniu i nasunięciu sekcji na okładkę, odwodnić je za pomocą serii roztworów alkoholu o stężeniu 50%, 70%, 95% i 100%.

Po etapie odwadniania przenieść skrawki do szklanej fiolki zawierającej 100% etanolu na wytrząsarce przez około 5 minut. Zastąp roztwór alkoholu tlenkiem propylenu i myj trzy razy przez 5 minut. Po ostatnim myciu trzymaj około 2 mililitrów tlenku propylenu w fiolce i dodaj żywicę w proporcji jeden do jednego.

Upewnij się, że żywica się rozpuściła i utrzymuj sekcje pod stałym mieszaniem przez 30 minut. Po 30 minutach za pomocą drewnianego patyczka umieść każdą sekcję w aluminiowej desce zawierającej żywicę epoksydową i inkubuj przez noc. Następnego dnia połóż deskę na gorącym talerzu na około 10 minut.

Następnie podnieś każdą sekcję drewnianym patyczkiem i umieść na czystej zjeżdżalni. Po przeniesieniu wszystkich skrawków na szkiełko należy obejrzeć szkiełko pod mikroskopem preparacyjnym, aby sprawdzić orientację plastrów i nałożyć na nie szkiełko nakrywkowe. Utwardzać w piekarniku przez 48 godzin w temperaturze 56 stopni Celsjusza.