Hybrydyzacja in situ przy użyciu sond oligonukleotydowych do badania ekspresji RNA w skrawkach mózgu szczura
JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 6:08 min. • July 8th, 2025
Weź stałe skrawki mózgu od szczura z zespołem serotoninowym, co prowadzi do zmienionej syntezy RNA receptora serotoninowego w neuronach.
Odwodnić tkankę za pomocą alkoholu. Zastosuj roztwór do obróbki wstępnej, aby dezaktywować endogenne enzymy hydrolizujące, zapobiegając ich interakcji z odczynnikami wykrywającymi.
Potraktuj wrzącym buforem, aby przerwać wiązania krzyżowe wywołane fiksacją, odsłaniając docelowe RNA.
Odwodnić tkankę, narysować barierę hydrofobową i inkubować ją z roztworem do przepuszczalności błon komórkowych.
Dodaj sondy oligonukleotydowe i inkubuj, umożliwiając sondom hybrydyzację z docelowymi RNA.
Przemyć, aby usunąć niezwiązane sondy, a następnie inkubować z odczynnikami do amplifikacji zawierającymi przedwzmacniacz, wzmacniacz i sondy znakowane sprzężone z enzymem, które wiążą się z sondami oligonukleotydowymi.
Inkubuj z substratami chromogennymi, które ulegają hydrolizie przez sondy sprzężone z enzymami, wytwarzając widoczny kolor.
Potraktuj ksylenem, aby zwiększyć przezroczystość tkanki, dodaj podłoże mocujące i nałóż szkiełko nakrywkowe.
Pod mikroskopem kolorowe plamki w tkance pomagają określić ilościowo docelową ekspresję RNA.
W tej procedurze, w celu od
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych