Hybrydyzacja in situ przy użyciu sond oligonukleotydowych do badania ekspresji RNA w skrawkach mózgu szczura

Weź stałe skrawki mózgu od szczura z zespołem serotoninowym, co prowadzi do zmienionej syntezy RNA receptora serotoninowego w neuronach.

Odwodnić tkankę za pomocą alkoholu. Zastosuj roztwór do obróbki wstępnej, aby dezaktywować endogenne enzymy hydrolizujące, zapobiegając ich interakcji z odczynnikami wykrywającymi.

Potraktuj wrzącym buforem, aby przerwać wiązania krzyżowe wywołane fiksacją, odsłaniając docelowe RNA.

Odwodnić tkankę, narysować barierę hydrofobową i inkubować ją z roztworem do przepuszczalności błon komórkowych.

Dodaj sondy oligonukleotydowe i inkubuj, umożliwiając sondom hybrydyzację z docelowymi RNA.

Przemyć, aby usunąć niezwiązane sondy, a następnie inkubować z odczynnikami do amplifikacji zawierającymi przedwzmacniacz, wzmacniacz i sondy znakowane sprzężone z enzymem, które wiążą się z sondami oligonukleotydowymi.

Inkubuj z substratami chromogennymi, które ulegają hydrolizie przez sondy sprzężone z enzymami, wytwarzając widoczny kolor.

Potraktuj ksylenem, aby zwiększyć przezroczystość tkanki, dodaj podłoże mocujące i nałóż szkiełko nakrywkowe.

Pod mikroskopem kolorowe plamki w tkance pomagają określić ilościowo docelową ekspresję RNA.

W tej procedurze, w celu odwodnienia, weź cztery szkiełka do pudełek na szkiełka mikroskopowe przechowywane w zamrażarce o temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza. Przypisz sekcje do testów genów ppiB, dapB i ht2a. Zaznacz je i oznacz długopisem.

Następnie zanurz szkiełka w 100% alkoholu w temperaturze pokojowej na pięć minut. Następnie suszyć szkiełka przez pięć minut w dygestorium. Do obróbki wstępnej należy odpipetować 20 mikrolitrów obróbki wstępnej po jednym odczynniku do każdej sekcji.

Umieść szkiełka na szynie stojaka w tacce na wilgoć. Delikatnie potrząsaj tacką na wilgoć na poziomej wytrząsarce na niskich obrotach przez 10 minut. Następnie umyj szkiełka dwukrotnie wodą podwójnie destylowaną przez dwie minuty. Zanurz szkiełka w zlewce o pojemności 1,000 mililitrów zawierającej 450 mililitrów odczynnika do obróbki wstępnej 2.

Następnie gotuj szkiełka przez łącznie pięć minut w temperaturze 100 stopni Celsjusza, aby przywrócić strukturę RNA. Następnie umyj szkiełka dwukrotnie wodą podwójnie destylowaną przez dwie minuty za każdym razem. Umieść szkiełka w 100% alkoholu na pięć minut.

Następnie suszyć szkiełka przez pięć minut w dygestorium. Użyj pisaka hydrofobowego, aby narysować okrąg wokół wybranego obszaru w sekcji tkanki. Następnie odpipetuj 10 mikrolitrów odczynnika do obróbki wstępnej do każdego wybranego obszaru, aby zwiększyć penetrację sondy, i przykryj tackę na wilgoć pokrywką.

Następnie umieść blachę w piekarniku hybrydyzacyjnym wyposażonym w wytrząsarkę poziomą. Ustaw temperaturę piekarnika na 40 stopni Celsjusza i delikatnie potrząsaj blachą przez 30 minut. Następnie umyj szkiełka dwukrotnie wodą podwójnie destylowaną przez dwie minuty za każdym razem.

Na tym etapie odpipetuj 10 mikrolitrów sondy ppiB, dapB lub htr2a na wybrane obszary. Następnie przykryj tackę na wilgoć pokrywką, aby zapobiec parowaniu odczynnika. Delikatnie potrząśnij szkiełkami na wytrząsarce poziomej z małą prędkością, inkubując je w temperaturze 40 stopni Celsjusza w piekarniku przez dwie godziny.

Następnie umyj szkiełka dwukrotnie buforem myjącym przez dwie minuty za każdym razem. Odpipetować 10 mikrolitrów odczynnika do amplifikacji 1 na każdy wybrany obszar. Wstrząśnij i inkubuj szkiełka w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie umyj szkiełka dwukrotnie buforem myjącym przez dwie minuty za każdym razem.

Odpipetować 10 mikrolitrów odczynnika do amplifikacji 2 na każdy wybrany obszar. Wstrząśnij i inkubuj szkiełka w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie umyj szkiełka dwukrotnie buforem myjącym przez dwie minuty za każdym razem.

Odpipetować 10 mikrolitrów odczynnika do amplifikacji 3 na każdym wybranym obszarze. Wstrząśnij i inkubuj szkiełka w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie umyj szkiełka dwukrotnie buforem myjącym przez dwie minuty.

Odpipetować 10 mikrolitrów odczynnika do amplifikacji 4 na każdy wybrany obszar. Wstrząśnij i inkubuj szkiełka w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie umyj szkiełka dwukrotnie buforem myjącym przez dwie minuty.

Odpipetować 10 mikrolitrów odczynnika do amplifikacji 5 na każdy wybrany obszar. Wstrząśnij i inkubuj szkiełka w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie umyj szkiełka dwukrotnie buforem myjącym przez dwie minuty.

Odpipetować 10 mikrolitrów odczynnika do amplifikacji 6 na każdy wybrany obszar. Wstrząśnij i inkubuj szkiełka w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie ponownie umyj szkiełka dwukrotnie buforem myjącym przez dwie minuty za każdym razem.

Teraz odpipetuj 10 mikrolitrów czerwonego odczynnika do każdego wybranego obszaru. Umieść szkiełka w tacce na wilgoć na poziomym wytrząsarce w temperaturze pokojowej i delikatnie potrząsaj na niskich obrotach przez 10 minut. Następnie umyj szkiełka dwukrotnie wodą podwójnie destylowaną przez 10 minut za każdym razem.

Szkiełka suszyć w temperaturze 60 stopni Celsjusza w piekarniku przez 15 minut. Następnie umieść szkiełka w ksylenie w dygestoriach na pięć minut. Następnie odpipetuj 20 mikrolitrów pożywki montażowej na bazie ksylenu na każdy wybrany obszar i przykryj szkiełkiem nakrywkowym.