Barwienie fluorescencyjne komórek grzebienia nerwowego hodowanych na hydrożelach o różnej sztywności

Weźmy przylegające hodowle komórek grzebienia nerwowego wyhodowane na szkiełkach nakrywkowych pokrytych hydrożelami o różnej sztywności. Umyj komórki buforem.

Dodaj paraformaldehyd, aby utrwalić komórki i zachować morfologię komórkową.

Umyj komórki buforem, aby usunąć nadmiar paraformaldehydu.

Następnie dodaj niejonowy detergent, aby przepuszczalność błon komórkowych.

Umyj komórki buforem, aby usunąć nadmiar detergentu.

Następnie wprowadź rozwiązanie blokujące, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu.

Inkubuj komórki za pomocą nitkowatej sondy aktynowej o wysokim powinowactwie, która wiąże się z filamentami aktyny.

Umyj ogniwa buforem, aby usunąć wszelkie niezwiązane sondy.

Dodaj fluorescencyjny barwnik jądrowy, aby zabarwić jądra, a następnie przemyj buforem, aby usunąć nadmiar barwnika.

Nałóż podłoże montażowe na szkiełka nakrywkowe i zbadaj wybarwione komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Komórki wyhodowane na sztywniejszych hydrożelach wykazują zwiększone tworzenie włókien aktynowych i bardziej rozproszoną morfologię niż te wyhodowane na bardziej miękkich hydrożelach.

Użyj pęsety, aby przetransportować szkiełka nakrywkowe na nową płytkę, aby zminimalizować fałszywe sygnały z komórek rosnących bezpośrednio na płytce. Następnie utrwal komórki za pomocą 500 mikrolitrów 4% paraformaldehydu przez 10 minut, a następnie potraktuj komórki 500 mikrolitrami 0,1% Triton X-100 w temperaturze pokojowej.

Po 15 minutach zablokuj komórki 250 mikrolitrami 10% surowicy osła. Wybarwić komórki pod kątem F-aktyny falloidyną w rozcieńczeniu od 1 do 400 w 250 mikrolitrach 10% surowicy osła, a następnie inkubować z DAPI przez 10 minut.

Umyj komórki PBS przez dwie minuty przed dodaniem trzech do czterech kropli pożywki montażowej do każdej studzienki. Na mikroskopie fluorescencyjnym uchwyć obrazy co najmniej trzech losowych ramek na próbkę hydrożelu, tworząc pojedyncze i połączone kanały.