Mikrodysekcja laserowa w celu wyizolowania komórek Purkinjego z ludzkiej pośmiertnej tkanki móżdżku

Weźmy ludzką pośmiertną tkankę móżdżku zawierającą warstwę komórek Purkinjego, granulek i komórek molekularnych.

Umieścić go na uchwycie na próbkę kriostatu zawierającym częściowo zamrożone podłoża do zatapiania.

Poczekaj, aż podłoże całkowicie zamarznie, zabezpieczając tkankę.

Przenieś ten zespół do ramienia tnącego kriostatu i pozwól tkance zaaklimatyzować się do temperatury kriostatu.

Przesuń tkankę bliżej ostrza i przytnij ją, aby odsłonić warstwy kory.

Umieść płytkę zabezpieczającą przed przewróceniem się nad ostrzem i uzyskaj sekcje móżdżku.

Przenieś te sekcje na szkiełko membranowe.

Inkubować w rosnących stężeniach etanolu w celu utrwalenia tkanek i odwodnienia.

Następnie inkubować w ksylenie.

Wysuszyć szkiełko i umieścić je na stoliku mikroskopu laserowego UV.

Umieść nasadkę zbierającą na tkance móżdżku.

Mikroskopowo skup się na komórkach Purkinjego.

Za pomocą lasera przechwyć i zbierz komórki Purkinjego do dalszej analizy.

Najpierw wytnij mały kawałek tkanki do cięcia, upewniając się, że przekrój składa się w około 95% z kory móżdżku. Umieść pozostałą tkankę z powrotem w suchym lodzie lub w zamrażarce w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Następnie zacznij powoli dodawać OCT na wierzch uchwytu powolnymi ruchami okrężnymi. Buduj warstwy OCT, aż powstanie kopiec o wysokości około trzech milimetrów przykrywający uchwyt.

Gdy OCT jest częściowo zamrożony, ale nadal ma trochę płynu w środku, umieść tkanki na wierzchu kopca. Pozostaw chusteczki na wierzchu OCT na 1 do 2 minut, aż całkowicie się zamrozi. Następnie przenieś uchwyt z zamrożonym OCT i tkanką do ramienia tnącego kriostatu. Wyreguluj chusteczkę tak, aby zlicowała się z ostrzem tnącym i pozostaw chusteczki w ramieniu tnącym na 20 minut, aby dostosować się do nowej temperatury.

Najważniejszym krokiem jest umożliwienie tkance aklimatyzacji w ramieniu tnącym kriostatu tak długo, jak to konieczne. Jeśli tkanka ulega rozdrobnieniu, wizualizacja komórek Purkinjego będzie bardzo trudna. Polecam używanie mniejszych, cieńszych kawałków tkanki, aby tkanka mogła się szybciej zaaklimatyzować.

Następnie powoli przesuń tkankę bliżej ostrza. Gdy tkanka dotrze do ostrza, rozpocznij proces przycinania. Przytnij tkankę 2 do 3 razy, aż warstwy kory będą widoczne.

Następnie umieść i wyrównaj płytkę zapobiegającą przetaczaniu się tuż nad ostrzem kriostatu. Wytnij od 4 do 6 odcinków o grubości 14 mikrometrów, zwracając uwagę, że prawidłowo przycięte odcinki będą płaskie pod płytą stabilizacyjną. Wyrównaj wycięte sekcje poziomo w poprzek stolika kriostatu.

Ustaw suwak pod kątem, aby jednocześnie podnieść wszystkie kawałki tkanki. Natychmiast po przecięciu tkanki umieść szkiełko w uchwycie na szkiełko z 70% etanolem na lodzie na 2 minuty. Przenieś szkiełko do uchwytu na szkiełko z 95% etanolem na lodzie na 45 sekund.

Następnie umieść szkiełko w uchwycie na szkiełko ze 100% etanolem w temperaturze pokojowej na 2 minuty. Zanurz szkiełko 3 razy w uchwycie szkiełka zawierającym ksylen numer 1 w temperaturze pokojowej. Następnie umieść szkiełko w uchwycie na szkiełko z ksylenem 2 w temperaturze pokojowej na 5 minut. Umieść szkiełka w czystym dygestorium i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez co najmniej 30 minut.

Najpierw użyj odkażonej RNazy do oczyszczenia stolika mikroskopu w ramieniu do zbierania nakrętek. Rękami w rękawiczkach umieść szkiełko na mikroskopie, a nieprzezroczystą nasadkę o pojemności 500 mikrolitrów w ramieniu zbiorczym. Przy małym powiększeniu wyrównaj nieprzezroczystą nasadkę na tkance móżdżku, upewniając się, że nasadka obejmuje cały obszar, który jest widoczny w okularze.

Użyj obiektywu od 5 do 10 razy, aby uwidocznić warstwy móżdżku. Umieść kursor nad sekcją, w której przecinają się warstwa molekularna i warstwa komórki ziarnistej. Przejdź do 40-krotnego powiększenia i wizualizuj komórki Purkinjego. Następnie zacznij je chwytać.