Przetwarzanie mózgu myszy do dalszej analizy

Weź świeżo zebrany mózg myszy i zamroź go błyskawicznie we wstępnie schłodzonym izopentanie, aby szybko zachować tkanki.

Następnie przenieś mózg, korą mózgową do góry, do zamrożonej macierzy mózgowej, aby utrzymać zimne środowisko podczas krojenia.

Pozwól mózgowi zrównoważyć się z temperaturą matrycy. Wyrównaj go w matrycy wzdłuż zatok strzałkowych i poprzecznych, aby zapewnić symetryczne przekroje.

Włóż schłodzone ostrza do mózgu, zapewniając prawidłowe ustawienie.

Następnie dociśnij je równomiernie, aby uzyskać jednolite sekcje mózgu.

Wyjmij ostrza z sekcjami i umieść je rostralną stroną do góry na zamarzniętej szklanej płycie.

Uporządkuj sekcje od orientacji rostralnej do ogonowej we właściwej kolejności anatomicznej. Teraz je rozdziel.

Korzystając z odpowiedniego odniesienia do mózgu, zlokalizuj i wytnij obszar zainteresowania z sekcji.

Przenieść wyciętą tkankę do wstępnie schłodzonej fiolki w celu dalszej analizy.

Po usunięciu mózgów z uśpionych dorosłych myszy dzikiego typu CD-1, błyskawicznie zamroź tkankę na 60 sekund w ciekłym azocie lub izopentanie, wstępnie schłodzonym suchym lodem i przechowuj ją w temperaturze -80 stopni Celsjusza.

Na 24 godziny przed wypreparowaniem tkanki umieść czystą matrycę mózgu na stosie rozmrożonych opakowań do zamrażania i ułóż boki matrycy między dwoma opakowaniami do zamrażania, upewniając się, że pozostawiłeś około pół centymetra między dolną częścią szczelin maszynki do golenia a górną częścią opakowań.

Ustaw zamrożoną szklaną płytkę do sekcji, wypełniając izolowane pudełko lodem do około 5 centymetrów od góry. Następnie ułóż na wierzchu 2,5-centymetrową warstwę suchego lodu i przykryj ją czarną folią. Umieść szklany talerz na plastiku i suchym lodzie wokół krawędzi talerza.

Wyjmij zamrożoną macierz mózgową z zamrażarki i włóż korę mózgową do góry do matrycy. Pozwól chusteczce zrównoważyć się z temperaturą w pudełku przez 10 minut, trzymając w tym czasie pokrywkę otwartą. Użyj zimnych kleszczy, aby dostosować położenie mózgu w macierzy, tak aby zatoka strzałkowa i zatoka poprzeczna pokrywały się z prostopadłymi rowkami bloku.

Gdy mózg znajdzie się na swoim miejscu, umieść schłodzoną żyletkę w pobliżu jej środka i wciśnij ją około 1 milimetra w tkankę. Następnie umieść po jednym schłodzonym ostrzu na każdym końcu mózgu i wciśnij je do końca. Następnie zacznij dodawać schłodzone ostrza na końcu rostralnym, umieszczając je pojedynczo w szczelinach i delikatnie wciskając je na 1 milimetr w tkankę. Kontynuuj dodawanie ostrzy w odstępach 1 milimetra, kierując się w stronę końca ogonowego.

Gdy wszystkie ostrza są na swoim miejscu, dociśnij górę palcami, dłonią lub przedmiotem i powoli kołysz nimi z boku na bok, aby przesuwać je przez tkankę. Gdy ostrza dotrą do dna szczelin, chwyć każdą stronę grupy ostrzy i uwolnij je z matrycy, kołysząc się w przód iw tył.

Po uwolnieniu grupy ostrzy umieść je rostralną stroną do góry na szklanej płytce i umieść suchy lód obok lub na szczycie stosu, aby dalej zamrozić próbki w celu łatwiejszego oddzielenia. Następnie ułóż stos ostrymi krawędziami w dół i oddziel ostrza, przesuwając stos między kciukiem a palcami.

Wyrównaj sekcję na szklanych płytkach od rostralnej do ogonowej i oddziel tkankę od ostrzy, zginając je między palcami lub oddzielając je drugim schłodzonym ostrzem. Czasami tkanka może przyklejać się do obu stron ostrza i należy zachować ostrożność, aby utrzymać orientację rostralną do ogonowej.

Przed rozpoczęciem sekcji otwórz atlas mózgu myszy Allen lub inny odnośnik i znajdź punkty orientacyjne niezbędne do zidentyfikowania interesujących regionów. Użyj schłodzonych kleszczy lub ostrzy, aby odwrócić sekcję i upewnij się, że obszar zainteresowania jest spójny w całej sekcji.

Wytnij sekcję czystym skalpelem lub stemplem, delikatnie, ale stanowczo wciskając metal w tkankę, kołysząc nim w przód iw tył, aby wykonać cięcie. Po zebraniu interesującego Cię regionu umieść go w oznaczonych, wstępnie schłodzonych 1,5-mililitrowych tubkach i przechowuj je w temperaturze -80 stopni Celsjusza.