Uzyskiwanie zawiesiny jednokomórkowej z zamrożonej tkanki mózgowej szczura

Rozmrozić fragment zamrożonej tkanki mózgowej szczura.

Dodaj bufor i zmiel tkankę. Następnie przenieś go do probówki zawierającej bufor i wymieszaj.

Odwirować mieszaninę i wyrzucić supernatant.

Dodaj roztwór enzymu proteolitycznego do tkanki i ponownie go zawieś za pomocą pipety o dużej średnicy.

Inkubuj mieszaninę, aby rozbić macierz zewnątrzkomórkową, rozluźniając komórki nerwowe.

Odwirować mieszaninę i wyrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić fragmenty tkanki w schłodzonym buforze i wielokrotnie je pipetować, aby zdysocjować komórki.

Poczekaj, aż zanieczyszczenia i niezdysocjowane komórki osiądą, a następnie przenieś zawiesinę jednokomórkową do nowej probówki.

Przenieś komórki do lodowatego etanolu i wymieszaj. Inkubuj je, aby utrwalić i przepuszczalnie komórki.

Odwirować zawiesinę i odrzucić supernatant.

Ponownie zawieś komórki nerwowe w zimnym buforze w celu dalszej analizy.

Aby zmielić tkankę, należy pozostawić próbki do rozmrożenia na zimnej szklanej płytce nie dłużej niż 1 minutę przed pokryciem próbek w jednej lub dwóch kroplach roztworu buforu A. Następnie, trzymając żyletkę całkowicie pionowo do płytki, zmiel tkankę 100 razy w każdym prostopadłym kierunku. Aby dokładnie zmielić tkankę, ważne jest, aby tkanka była mokra z buforem A i przestrzegała określonych czasów i wskazówek mielenia.

Bardzo ważne jest, aby usunąć większość istoty białej podczas rozwarstwiania tkanek i utrzymać tkankę pokrytą buforem A, aby poprawić wydajność mielenia i utrzymać zdrowie komórek.

Gdy tkanka zostanie dokładnie przetworzona, użyj żyletki, aby przenieść kawałki do probówki mikrowirówki zawierającej 1 mililitr zimnego buforu A i odwróć probówkę trzy do pięciu razy, aby zanurzyć całą zmieloną tkankę w roztworze. Aby zdysocjować fragmenty tkanek na zawiesinę pojedynczej komórki, próbki należy granulować przez odwirowanie.

Wyrzuć supernatant, a następnie powoli dodaj 1 mililitr zimnego, świeżo rozmrożonego roztworu enzymatycznego w dół wewnętrznej ścianki mikroprobówki i użyj pipety o dużej średnicy końcówki, aby natychmiast zassać i dozować całość każdej granulki cztery razy, aby rozproszyć zmielone kawałki tkanki. Następnie szybko odwróć mikroprobówkę, aby zapobiec przywieraniu granulek do dna probówki, i inkubuj próbkę z mieszaniem koniec po końcu przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Pod koniec trawienia ponownie odwirować probówkę i dodać 0,6 mililitra zimnego buforu A do komórek. Używając tej samej końcówki do pipet, natychmiast zassaj i dozuj granulki pięć razy, a następnie wybierz szklaną pipetę o średnicy 1,3 milimetra i użyj jej do delikatnego miareczkowania próbek 10 razy.

Umieścić próbkę na lodzie na 2 minuty, aby umożliwić szczątkom i niezdysocjowanym komórkom osiądnięcie na dnie probówki. Następnie przenieś supernatant do nowej 15-mililitrowej probówki. Następnie przenieś 800 mikrolitrów komórek z pierwszej probówki zebranego supernatantu do każdej z pierwszych dwóch probówek etanolu.

Odwróć probówki, aby wymieszać próbki. Następnie umieścić próbki na lodzie na 15 minut z mieszaniem przez odwrócenie co 5 minut. Pod koniec inkubacji odwirować komórki. Następnie, dotykając tylko ścianki mikroprobówki, użyj mikropipety, aby powoli usunąć wszystkie oprócz ostatnich 50 mikrolitrów każdego supernatantu.