Ocena stanu palmitoylacji białek błony komórkowej z tkanki mózgowej myszy

Weź białka błony komórkowej z tkanki mózgowej myszy.

Białka te wykazują modyfikację potranslacyjną z grupami palmitoilowymi, kwasem tłuszczowym, przyłączonym do reszt cysteiny.

Dodaj bufor redukujący i inkubuj w wysokiej temperaturze, aby zerwać wiązania między niepalmitoilowanymi cysteinami, odsłaniając je.

Inkubować z odczynnikiem blokującym, który wiąże się z odsłoniętymi cysteinami, pozostawiając reaktywne tylko cysteiny palmitoilowane.

Przenieś roztwór, wymieszaj go z chloroformem, metanolem i wodą dejonizowaną, odwiruj w celu wytrącenia białek i usuń wszelkie zanieczyszczenia. Następnie dodaj metanol, odwiruj i wyrzuć wszelkie pozostałe zanieczyszczenia.

Dodaj bufor, poddaj sonikacji, aby rozpuszczono osad, a następnie odwiruj i usuń nierozpuszczalne materiały.

Zastosuj odczynnik rozszczepiający, aby usunąć grupy palmitoilowe z palmitoilowanych cystein.

Powtórzyć wytrącanie chloroformu i metanolu i usunąć wszelkie zanieczyszczenia.

Inkubuj z polimerem, który wiąże się z niezablokowanymi cysteinami, pomagając zidentyfikować białka palmitoilowane.

Powtórzyć wytrącanie chloroformu i metanolu i usunąć wszelkie niezwiązane polimery.

Zawiesić osad w celu dalszej analizy stanu palmitoilacji wyizolowanych białek.

Najpierw rozerwij wiązania dwusiarczkowe poprzez inkubację rozpuszczonego białka w 25 mikrolitrach TCEP przez 60 minut w temperaturze 55 stopni Celsjusza. Następnie zablokuj wolne cysteiny, inkubując roztwór z 12,5 mikrolitrami roztworu podstawowego NEM przez trzy godziny w temperaturze pokojowej.

Następnie rozpocznij proces wytrącania chloroformu i metanolu. Przenieś roztwór białka z 1,5-mililitrowej probówki do polipropylenowej lub szklanej probówki, którą można odwirować w wahadłowym wirniku kubełkowym ze skromną prędkością. Dodaj 2 mililitry metanolu i krótko zmieszaj. Dodaj 1 mililitr chloroformu i krótko zmieszaj. Następnie dodaj 1,5 mililitra wody dejonizowanej i ponownie krótko zmieszaj.

W razie potrzeby odwróć rurkę, aby zapewnić dokładne wymieszanie. Odwirować próbki w temperaturze 3 000 razy G i 25 stopni Celsjusza przez 30 minut w kołyszącym się wirniku kubełkowym. Ostrożnie wyjmij i wyrzuć górną fazę roztworu do probówki. Dodaj 1,5 mililitra metanolu. Wymieszaj delikatnie, ale dokładnie poprzez delikatne odwrócenie tuby, uważając, aby nie rozdrobnić nieprzezroczystego naleśnika białkowego.

Odwirować próbkę w temperaturze 3 000 razy G i 25 stopni Celsjusza przez 10 minut w kołyszącym się wirniku kubełkowym. Za pomocą szklanej pipety serologicznej usuń jak najwięcej górnej fazy roztworu, nie naruszając naleśnika białkowego. Ostrożnie spłucz granulkę 1 mililitrem metanolu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez co najmniej 10 minut.

Po zakończeniu wytrącania chloroformu i metanolu rozpocznij rozszczepianie wiązań tioestrów palmitoilu poprzez ponowne zawieszenie osadu białkowego w 125 mikrolitrach buforu A. Przenieś do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Krótko poddaj probówkę działaniu sonikacji, a następnie odwiruj ją w temperaturze 13 000 razy G lub wyższej i 25 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby usunąć nierozpuszczalny materiał.

Przenieś rozpuszczone białko do nowych 1,5-mililitrowych probówek i dodaj 375 mikrolitrów buforu H lub buforu T. Po inkubacji próbek przez 60 minut w temperaturze pokojowej powtórzyć wytrącanie chloroformu i metanolu. Aby dodać mPEG do niezabezpieczonych cystein, należy rozpocząć od ponownego zawieszenia osadu w 100 mikrolitrach buforu A zawierającego 10 milimolowy TCEP.

Następnie przenieś zawiesinę do 1,5 mililitrowej tuby. Dodać 25 mikrolitrów podstawowego roztworu mPEG 5k i wymieszać pipetując. Inkubować w temperaturze pokojowej z obrotem od końca do końca. Po 60 minutach inkubacji usunąć niewbudowany mPEG 5k, ponownie wytrącając metanol chloroformowy.

Wirować w temperaturze większej niż 13 000 razy G i 25 stopni Celsjusza przez 10 minut. Ostrożnie usuń górną fazę jak poprzednio, unikając grubego kłaczkowatego naleśnika. Dodaj 1 mililitr metanolu i delikatnie, ale dokładnie wymieszaj. Wirować w temperaturze większej niż 13 000 razy G i 25 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Ostrożnie usunąć sklarowany osad i przepłukać osad 1 mililitrem metanolu. Ponownie odwiruj w temperaturze większej niż 13 000 razy G i 25 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po wysuszeniu na powietrzu osad zawieszony w 50 mikrolitrach buforu A bez TCEP lub jakiegokolwiek środka redukującego.