Ocena stanu palmitoylacji białek błony komórkowej z tkanki mózgowej myszy
JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 5:45 min. • July 8th, 2025
Weź białka błony komórkowej z tkanki mózgowej myszy.
Białka te wykazują modyfikację potranslacyjną z grupami palmitoilowymi, kwasem tłuszczowym, przyłączonym do reszt cysteiny.
Dodaj bufor redukujący i inkubuj w wysokiej temperaturze, aby zerwać wiązania między niepalmitoilowanymi cysteinami, odsłaniając je.
Inkubować z odczynnikiem blokującym, który wiąże się z odsłoniętymi cysteinami, pozostawiając reaktywne tylko cysteiny palmitoilowane.
Przenieś roztwór, wymieszaj go z chloroformem, metanolem i wodą dejonizowaną, odwiruj w celu wytrącenia białek i usuń wszelkie zanieczyszczenia. Następnie dodaj metanol, odwiruj i wyrzuć wszelkie pozostałe zanieczyszczenia.
Dodaj bufor, poddaj sonikacji, aby rozpuszczono osad, a następnie odwiruj i usuń nierozpuszczalne materiały.
Zastosuj odczynnik rozszczepiający, aby usunąć grupy palmitoilowe z palmitoilowanych cystein.
Powtórzyć wytrącanie chloroformu i metanolu i usunąć wszelkie zanieczyszczenia.
Inkubuj z polimerem, który wiąże się z niezablokowanymi cysteinami, pomagając zidentyfikować białka palmitoilowane.
Powtórzyć wytrącanie chloroformu i metanolu i usunąć wszelkie niezwiązane polimery.
Zawiesić osad w celu dalszej analizy stanu palmi
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych