JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:08 min. • July 8th, 2025
Weźmy ścianę ciała larw Drosophila, składającą się z mięśni unerwionych przez neurony ruchowe w celu utworzenia połączeń nerwowo-mięśniowych lub NMJ.
Postsynaptyczna błona mięśniowa w NMJ zawiera oddziałujące białka związane z błoną, które są znakowane pierwszorzędowymi przeciwciałami.
Dodaj test ligacji zbliżeniowej lub PLA, sondy zawierające przeciwciała drugorzędowe sprzężone z jednoniciowymi oligonukleotydami. Inkubuj, aby sondy związały się z przeciwciałami pierwotnymi.
Zmyj wszelkie niezwiązane sondy.
Inkubować z buforem ligacyjnym zawierającym oligonukleotydy łącznikowe i enzymy ligazy.
Bliskość oddziałujących białek ułatwia wiązanie konektorów z sondami. Ligaza następnie uszczelnia luki, tworząc koliste DNA.
Zmyj wszystkie niezwiązane złącza.
Inkubować z roztworem amplifikacyjnym zawierającym polimerazę, która amplifikuje koliste DNA poprzez amplifikację toczącego się koła.
Detektor znakowany fluoroforem sonduje w roztworze wyżarzanie do amplifikowanego DNA, a po wzbudzeniu wytwarza sygnał fluorescencyjny.
Zamontuj ścianę ciała na szkiełku, aby uwidocznić fluorescencyjnie znakowane interakcje białko-białko w NMJ.
Aby rozpocząć test, dodaj do ścian ciała rozcieńczenie od 1 do 5 w co najmniej 200 mikrolitrach całkowitej objętości zarówno sondy PLA anty-mysiej minus, jak i sondy PLA anty-królika plus w 1% BSA. Inkubować przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Po użyciu buforu płuczącego A do dwukrotnego przemycia ścian ciała przez 5 minut każda, dodać rozcieńczenie ligazy od 1 do 40 w roztworze ligazy. Inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Po inkubacji użyć buforu A do przemywania ścian ciała dwa razy przez 2 minuty przed dodaniem rozcieńczenia polimerazy w ilości od 1 do 80 w roztworze amplifikacyjnym. Inkubować przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Aby przygotować próbki do obrazowania, należy użyć buforu B do przemywania ścian ciała dwukrotnie po 10 minut każde. Następnie użyj 100-krotnego rozcieńczenia buforu do mycia B, aby wykonać końcowe płukanie przez 1 minutę. Równoważ ściany ciała w kilku kroplach roztworu montażowego przez co najmniej 30 minut.
Za pomocą cienkich kleszczyków ostrożnie przenieś ściany ciała na zjeżdżalnię platformową ze skórkami skierowanymi w dół. Ustaw je w rzędach w tej samej orientacji w odległości jednej lub dwóch kropli od roztworu montażowego. Na preparacie należy nałożyć szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 milimetry na 40 milimetrów, uważając, aby nie wytworzyć pęcherzyków powietrza. Następnie użyj przezroczystego lakieru do paznokci, aby uszczelnić szkiełko.