JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:08 min. • July 8th, 2025
Weźmy ścianę ciała larw Drosophila, składającą się z mięśni unerwionych przez neurony ruchowe w celu utworzenia połączeń nerwowo-mięśniowych lub NMJ.
Postsynaptyczna błona mięśniowa w NMJ zawiera oddziałujące białka związane z błoną, które są znakowane pierwszorzędowymi przeciwciałami.
Dodaj test ligacji zbliżeniowej lub PLA, sondy zawierające przeciwciała drugorzędowe sprzężone z jednoniciowymi oligonukleotydami. Inkubuj, aby sondy związały się z przeciwciałami pierwotnymi.
Zmyj wszelkie niezwiązane sondy.
Inkubować z buforem ligacyjnym zawierającym oligonukleotydy łącznikowe i enzymy ligazy.
Bliskość oddziałujących białek ułatwia wiązanie konektorów z sondami. Ligaza następnie uszczelnia luki, tworząc koliste DNA.
Zmyj wszystkie niezwiązane złącza.
Inkubować z roztworem amplifikacyjnym zawierającym polimerazę, która amplifikuje koliste DNA poprzez amplifikację toczącego się koła.
Detektor znakowany fluoroforem sonduje w roztworze wyżarzanie do amplifikowanego DNA, a po wzbudzeniu wytwarza sygnał fluorescencyjny.
Zamontuj ścianę ciała na szkiełku, aby uwidocznić fluorescencyjnie znakowane interakcje białko-białko w NMJ.
Aby rozpocząć test, dodaj do ścian ciała rozcieńczenie od 1 d
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych