Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila

Weźmy przystosowaną do ciemności, znieczuloną, transgeniczną, białooką muchę.

Mucha wyraża kanały jonowe TRPL oznaczone eGFP w fotoreceptorach oka.

W ciemności TRPL lokalizuje się na błonach rabdomore - mikrokosmkach fotoreceptorów.

Używając sprężonego powietrza, wepchnij muchę głową w dół do końcówki pipety.

Przytnij końcówkę i popchnij rozporek do tyłu.

Przytnij go ponownie i popchnij muchę do przodu, aż wystaje tylko jej głowa.

Unieruchamić końcówkę w modelance przyklejonej do szkiełka i umieścić ją na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego, z okiem skierowanym promieniście w stronę obiektywu mikroskopu.

Dodaj kroplę wody do obiektywu, a następnie opuść ją, aż dotknie oka.

Zrób zdjęcia fotoreceptorów.

Zmierz intensywność fluorescencji w rabdomere, ciele komórki i tle.

Oświetl muchę pomarańczowym światłem, aby wywołać translokację TRPL do ciała komórki.

Powtórz pomiary obrazowania i fluorescencji.

Porównaj obrazy, aby zaobserwować zmniejszoną fluorescencję rabdomeralną po oświetleniu, wskazującą na translokację TRPL do ciała komórki.

Aby przygotować muchę w odmianie nieśmiertelnej, przenieś znieczuloną lodem muchę głową w dół do końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów i ostrożnie popchnij muchę w kierunku końcówki za pomocą sprężonego powietrza. Następnie za pomocą skalpela odetnij końcówkę pipety tuż przed głową. I za pomocą pęsety ostrożnie wepchnij muchę na kilka milimetrów w końcówkę pipety.

Ponownie odetnij końcówkę pipety. I popchnij muchę z powrotem w kierunku końcówki za pomocą sprężonego powietrza, tak aby tylko główka muchy wystawała z końcówki pipety. Po przyklejeniu kawałka plasteliny do szkiełka podstawowego wciśnij w niego końcówkę pipety tak, aby lewe lub prawe oko było skierowane do góry. Upewnij się, że oko jest prawidłowo zorientowane pod mikroskopem. Aby uzyskać zdjęcie, wybierz obiektyw zanurzony w wodzie.

W przypadku odmiany nieśmiertelnej należy użyć pipety laboratoryjnej, aby przykleić dużą kroplę schłodzonej wody do spodu obiektywu zanurzenia w wodzie. Ostrożnie umieść szkiełko z przygotowanym muchą na stoliku mikroskopu. Następnie ręcznie opuść obiektyw zanurzenia w wodzie, aż zetknie się z powierzchnią wody lub oko muchy dotknie kropli.

Następnie przełącz ścieżkę światła w kierunku kamery mikroskopu i wygeneruj obraz na żywo. Ponownie wyreguluj ostrość kamery i oceń orientację oka, biorąc pod uwagę, że oko musi być skierowane promieniowo na obiektyw mikroskopu. Użyj oprogramowania tabeli przeglądowej, aby wykryć przesycenie.

W przypadku much niepigmentowanych dostosuj czas ekspozycji tak, aby najjaśniejsze piksele znajdowały się tuż poniżej limitu nasycenia dla każdego obrazu. Nagraj obraz i zapisz go jako plik RAW, aby zarchiwizować wszystkie odpowiednie metadane nagrania. Następnie wyeksportuj obraz w formacie TIFF z kropkami.

Aby określić ilościowo względną fluorescencję EGFP w rabdomore mikrofotografii zanurzonych w wodzie, dostosuj ustawienia ImageJ, klikając Analizuj. Następnie ustaw pomiary i zaznacz tylko pole średniej wartości szarości. Zaimportuj obraz TIFF z kropką, klikając Plik, a następnie Otwórz. Wybierz reprezentatywny obszar obrazu, na którym ustawiona jest ostrość, i powiększ go od 200% do 300%, naciskając jednocześnie Control i Plus.

Następnie wybierz narzędzie Owal. Naciskając Shift, wygeneruj okrągłe zaznaczenie na obrazie, które jest znacznie mniejsze niż jedna fluorescencyjna rabdomera. Następnie poszukaj dokładnego rozmiaru wyświetlanego pod paskiem narzędzi w oknie głównym ImageJ. Aby zmierzyć intensywność fluorescencji w zaznaczeniu kołowym, przesuń okrąg do pierwszego rabdomeru za pomocą strzałek na klawiaturze, a następnie kliknij przycisk Analizuj, a następnie zmierz

.

Pojawi się okno wyników z listą zmierzonej wartości szarości. Kontynuuj pomiary rabdomerów od 2 do 6, a także zmierz sygnał tła. W przypadku much niepigmentowanych należy wykonać dodatkowe pomiary odpowiednich obszarów ciała komórki. Zmierz fluorescencję dwóch kolejnych ommatidiów, co daje trzy kontrpróby techniczne. Zaznacz analizowaną ommatidię za pomocą narzędzia ołówka i zapisz ten obraz do dokumentacji.

Wybierz i skopiuj zmierzone wartości szarości z okna wyników i wklej je do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszych obliczeń. Posortuj wartości intensywności fluorescencji według ich pochodzenia w rabdomerze, korpusie komórki i tle kategorii, a następnie oblicz średnią intensywność z każdej kategorii. Następnie oblicz względną ilość EGFP obecnego w rabdomerze, używając pierwszego wzoru dla oczu bez pigmentacji, a drugiego dla oczu pigmentowanych.