Wykrywanie modyfikacji histonów w komórkach drożdży z nadekspresją białek neurodegeneracyjnych

Zacznij od zawiesiny białek z nadekspresją komórek drożdży związanych z chorobami neurodegeneracyjnymi.

To nadekspresja białka jest odpowiedzialne za modyfikacje w białkach upakowujących DNA lub histonach z chemicznymi ugrupowaniami.

Dodaj wodorotlenek sodu i beta-merkaptoetanol, a następnie inkubuj na lodzie.

Wodorotlenek sodu i beta-merkaptoetanol powodują lizę komórek, uwalniając białka wewnątrzkomórkowe, w tym histony.

Odwiruj lizat, aby zebrać białka. Odrzucić supernatant.

Dodaj barwnik ładujący do granulek białka i podgrzej go, aby je zdenaturować.

Załaduj te zdenaturowane białka i marker białkowy na żel i elektroforę, aby oddzielić je według rozmiaru.

Elektrotransferuj białka na membranę, umyj i dodaj bufor blokujący, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu.

Dodaj przeciwciała pierwszorzędowe, które specyficznie wiążą się ze zmodyfikowanymi histonami.

Umyj w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał i inkubuj z fluorescencyjnymi przeciwciałami drugorzędowymi, które wiążą się z przeciwciałami pierwszorzędowymi.

Wyraźny fluorescencyjny pas potwierdza modyfikacje histonów, wskazując na nadekspresję białek neurodegeneracyjnych.

Aby zlizować komórki do analizy western blot, rozmrozić granul