Wykrywanie białka α-synukleiny związanego z chorobą neurodegeneracyjną za pomocą testu ELISA

Zacznij od tkanki mózgowej transgenicznej myszy z nadekspresją zmutowanej α-synukleiny, nieprawidłowo sfałdowanego białka neuronalnego związanego z chorobą neurodegeneracyjną, zanurzonej w buforze o wysokiej zawartości soli.

Homogenizuj tkankę za pomocą dużego tłuczka, a następnie małego tłuczka, aby rozbić tkankę i uwolnić białka wewnątrzkomórkowe, w tym α-synukleinę.

Przenieść homogenat do probówki i odwirować. Zebrać supernatant zawierający białko i rozcieńczyć go buforem.

Dodaj ten supernatant do mikropłytki pokrytej przeciwciałami specyficznymi dla α-synukleiny, wstępnie potraktowanej środkiem blokującym, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu.

Inkubować z mieszaniem, umożliwiając wiązanie się normalnej i zmutowanej α-synukleiny.

Umyć płytkę, a następnie dodać przeciwciała wykrywające specyficzne dla zmutowanej α-synukleiny i inkubować z mieszaniem.

Ponownie umyć i dodać przeciwciała związane z enzymami, a następnie inkubować pod wpływem mieszania.

Dodaj substrat i inkubuj w ciemności pod mieszaniem. Substrat reaguje z enzymem, powodując zmianę koloru.

Zatrzymaj reakcję z kwasem i zmierz absorbancję, aby określić ilościowo zmutowaną α-synukleinę.

Aby przygotować homogenaty mózgu, doda