Wykrywanie białka α-synukleiny związanego z chorobą neurodegeneracyjną za pomocą testu ELISA
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 4:37 min • April 28th, 2025
Zacznij od tkanki mózgowej transgenicznej myszy z nadekspresją zmutowanej α-synukleiny, nieprawidłowo sfałdowanego białka neuronalnego związanego z chorobą neurodegeneracyjną, zanurzonej w buforze o wysokiej zawartości soli.
Homogenizuj tkankę za pomocą dużego tłuczka, a następnie małego tłuczka, aby rozbić tkankę i uwolnić białka wewnątrzkomórkowe, w tym α-synukleinę.
Przenieść homogenat do probówki i odwirować. Zebrać supernatant zawierający białko i rozcieńczyć go buforem.
Dodaj ten supernatant do mikropłytki pokrytej przeciwciałami specyficznymi dla α-synukleiny, wstępnie potraktowanej środkiem blokującym, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu.
Inkubować z mieszaniem, umożliwiając wiązanie się normalnej i zmutowanej α-synukleiny.
Umyć płytkę, a następnie dodać przeciwciała wykrywające specyficzne dla zmutowanej α-synukleiny i inkubować z mieszaniem.
Ponownie umyć i dodać przeciwciała związane z enzymami, a następnie inkubować pod wpływem mieszania.
Dodaj substrat i inkubuj w ciemności pod mieszaniem. Substrat reaguje z enzymem, powodując zmianę koloru.
Zatrzymaj reakcję z kwasem i zmierz absorbancję, aby określić ilościowo zmutowaną α-synukleinę.
Aby przygotować homogenaty mózgu, dodaj odpowiednią objętość buforu HS do wypreparowanych obszarów mózgu, aby osiągnąć oczekiwany procent homogenatu, jak pokazano w poniższej tabeli. Za pomocą młynka do tkanek składającego się z rurki ze szkła borokrzemianowego i dwóch tłuczków, A i B, wlej do probówki obszar mózgu, który ma zostać zmiażdżony. A następnie za pomocą tłuczka A homogenizuj tkankę 10 razy, aby ją zdysocjować.
Następnie przełącz się na tłuczek B i homogenizuj dodatkowe 20 razy. Za pomocą pipety transferowej przenieś homogenat do probówki o pojemności 1,5 mililitra, powtarzając homogenizację z pozostałymi próbkami mózgu. Odwirować próbki o masie 1000 g przez pięć minut, w temperaturze czterech stopni Celsjusza. A następnie zbierz supernatanty i podziel je na podwielokrotności o pojemności 200 mikrolitrów.
Za pomocą 100 mikrolitrów roztworu powlekającego przeciwciała pokryj dołki 96 mikropłytek dołkowych i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia dodaj 300 mikrolitrów PBST do studzienek i użyj myjki do talerzy, aby umyć płytki pięć razy. Pracując w temperaturze pokojowej, idąc dalej, dodaj 200 mikrolitrów buforu blokującego T20 PBS do każdej studzienki i potrząsaj płytkami z prędkością 150 obr./min przez godzinę przed użyciem PBST do pięciokrotnego umycia płytek.
Stosując PBST, 1% BSA, rozcieńczyć homogenaty mózgu, postępując zgodnie z wytycznymi wymienionymi tutaj. I dodaj 100 mikrolitrów do każdej studzienki. Następnie inkubować w temperaturze pokojowej i 150 obr./min przez dwie godziny przed użyciem PBST do pięciokrotnego umycia płytek.
Po ostatnim płukaniu dodać niezbędne przeciwciała wykrywające alfa synukleinę rozcieńczone w PBST i 1% BSA, jak podano w tabeli drugiej protokołu tekstowego. Inkubować w temperaturze pokojowej i 150 obr./min przez godzinę przed umyciem płytek pięć razy, tak jak poprzednio.
Następnie dodać anty-mysie lub anty-królicze koniugaty IGG HRP rozcieńczone do 1 do 8,000 w PBST, 1% BSA. I inkubować z prędkością 150 obr./min przez godzinę przed pięciokrotnym umyciem płytek. Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu TMB do każdej studzienki i inkubuj z prędkością 150 obr./min przez 15 minut w ciemności. Zatrzymaj reakcję, dodając 100 mikrolitrów jednego normalnego kwasu solnego na studzienkę. Następnie użyj czytnika mikropłytek, aby zmierzyć absorbancję przy 450 nanometrach.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół wykrywania związanej z chorobą α-synukleiny w tkance mózgowej myszy transgenicznych nadprodukujących zmutowaną ludzką α-synukleinę A53T przy użyciu ulepszonej metody ELISA. Procedura ta umożliwia czułą kwantyfikację zarówno prawidłowych, jak i zmutowanych form α-synukleiny, co ma istotne znaczenie dla badań nad chorobami neurodegeneracyjnymi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Badania nad chorobami neurodegeneracyjnymi
- Biochemia białek
Wstęp
- α-synucleina jest białkiem neuronalnym uwikłanianym w choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Parkinsona.
- Mutacje w α-synucleinie, takie jak A53T, są powiązane z patologią choroby.
- Ilościowe oznaczanie α-synucleiny powiązanej z chorobą w tkance mózgowej jest istotne dla zrozumienia mechanizmów i progresji schorzenia.
- Metoda ELISA stanowi czuły i specyficzny sposób wykrywania białek w próbkach biologicznych.
Cel badania
- Ustanowienie solidnego protokołu wykrywania i kwantyfikacji zmutowanej α-synukleiny w tkance mózgowej myszy.
- Umożliwienie rozróżnienia między prawidłowymi a związanymi z chorobą formami α-synukleiny.
- Zapewnienie powtarzalnej metody do zastosowania w modelach chorób neurodegeneracyjnych.
Zastosowane metody
- Wycinanie i homogenizacja tkanki mózgowej myszy transgenicznych w buforze wysokosolnym przy użyciu szklanych tłuczków.
- Wirowanie w celu oddzielenia nadsączu zawierającego białka oraz przygotowanie alikwotów.
- Powlekanie mikropłytek 96-dołkowych przeciwciałami specyficznymi dla α-synucleiny oraz blokowanie w celu zapobiegania niespecyficznemu wiązaniu.
- Inkubacja rozcieńczonych homogenatów mózgu w powlekłych dołkach, a następnie sekwencyjna inkubacja z przeciwciałami detekcyjnymi i znakowanymi enzymatycznie przeciwciałami wtórnymi.
- Detekcja kolorymetryczna z użyciem substratu TMB i pomiar absorbancji przy 450 nm w celu ilościowego oznaczenia poziomu α-synucleiny.
Główne wyniki
- Protokół umożliwia czułe wykrywanie zarówno prawidłowej, jak i zmutowanej α-synukleiny w homogenatach mózgu myszy.
- Ulepszony test ELISA pozwala na ilościowe oznaczenie form α-synukleiny związanych z chorobą.
- Metoda wykazuje specyficzność dzięki zastosowaniu przeciwciał detekcyjnych specyficznych dla danej mutacji.
- Wyniki mogą być wykorzystane do porównania poziomów α-synukleiny w różnych grupach eksperymentalnych lub modelach chorobowych.
Wnioski
- Ten ulepszony protokół ELISA zapewnia niezawodne i czułe podejście do wykrywania powiązanej z chorobą α-synukleiny w tkance mózgowej.
- Metoda ta jest odpowiednia do badań nad rolą α-synukleiny w chorobach neurodegeneracyjnych.
- Ułatwia ona ilościową analizę patologii białek w transgenicznych modelach mysich.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe wykrywanie α-synukleiny związanej z chorobą przy użyciu metody ELISA umożliwia solidną walidację celu oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi. Ten schemat postępowania zwiększa pewność prognostyczną na wczesnych etapach odkrywania i w punktach przegięcia przedklinicznego, dostarczając podstaw do decyzji portfelowych dla programów terapeutycznych celujących w proteinopatie. Wiarygodny pomiar poziomów zmutowanej α-synukleiny w modelach transgenicznych stanowi podstawę ciągłości translacyjnej od fazy odkrywania do walidacji przedklinicznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie α-synukleiny jako istotnego w kontekście choroby celu w modelach neurodegeneracji.
- Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez odróżnianie prawidłowych form białka od form zmutowanych.
- Dostarcza danych ilościowych dla zwiększenia pewności predykcyjnej w badaniach nad wiązaniem z celem.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane, powtarzalne wyniki testu ELISA do dalszego przesiewu związków.
- Ułatwia standaryzację i skalowalność testu w różnych kohortach eksperymentalnych.
- Umożliwia wiarygodne porównanie poziomu α-synucleiny pomiędzy grupami eksperymentalnymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z ilościowym określaniem biomarkerów istotnych dla choroby w transgenicznych modelach mysich.
- Zapewnia ciągłość od wczesnej fazy odkryć po przedkliniczną walidację hipotez terapeutycznych.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ilościową patologię białek.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda detekcji oparta na teście ELISA integruje się z continuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych w programach dotyczących chorób neurodegeneracyjnych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia ilościową weryfikację hipotez dotyczących udziału α-synukleiny w modelach chorób.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki analiz do oceny związków chemicznych.
- Analityka: Umożliwia pomiar poziomu białek w oparciu o absorbancję w celu porównań statystycznych.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia z przedkliniczną walidacją biomarkerów w odpowiednich modelach.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Oferuje zestandaryzowaną, adaptacyjną platformę do ilościowego oznaczania białek w ramach programów badawczych nad chorobami neurodegeneracyjnymi.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, odtwarzalność i skalowalność procesów detekcji białek.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową poprzez dostarczenie solidnych danych ilościowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój projektów dotyczących chorób neurodegeneracyjnych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w biochemii białek oraz w opracowywaniu testów ELISA.
- Wymaga dostępu do czytników mikropłytek, zwalidowanych przeciwciał i standaryzowanych odczynników.
- Wymaga rygorystycznej standaryzacji protokołów homogenizacji i analiz pomiędzy zespołami.
- Możliwość dostosowania do różnych transgenicznych lub modelowych systemów chorobowych przy odpowiednim doborze przeciwciał.
- Zależność od precyzyjnego przygotowania próbek i kontroli inkubacji w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
Często zadawane pytania dotyczące Biofarmacji
Sekwencyjna ekstrakcja rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej alfa-synukleiny z mózgów parkinsonowskich
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Obrazowanie bioluminescencyjne zapalenia układu nerwowego u myszy transgenicznych po obwodowej inokulacji włókien alfa-synukleiny
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Wytwarzanie włókienek preformowanych alfa-synukleiną z monomerów i stosowanie in vivo
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Wykrywanie fosforylowanej alfa-synukleiny za pomocą Western Blotting
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Test immunofluorescencyjny do wykrywania agregatów alfa-synukleiny w sekcji biopsji skóry
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Barwienie immunologiczne neuronów traktowanych agregatami alfa-synukleiny
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Wykrywanie białka α-synucleiny związanego z chorobą za pomocą ulepszonego testu ELISA w mózgu transgenicznych myszy nadmiernie ekspresujących ludzkie α-synucleinę z mutacją A53T
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Wysokoprzepustowy, multipleksowany i ukierunkowany test proteomiczny, płyn mózgowo-rdzeniowy do ilościowego określania biomarkerów neurodegeneracyjnych i statusu izoform apolipoproteiny E
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Egzogenne podawanie agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami do neuronów pierwotnych jako potężny model komórkowy tworzenia włókienek
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Celowanie w agregaty alfa synukleiny w obwodowych włóknach nerwowych skóry za pomocą swobodnego testu immunofluorescencji
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Ostatnia aktualizacja: 22 sierpnia 2026