$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Zacznij od tkanki mózgowej transgenicznej myszy z nadekspresją zmutowanej α-synukleiny, nieprawidłowo sfałdowanego białka neuronalnego związanego z chorobą neurodegeneracyjną, zanurzonej w buforze o wysokiej zawartości soli.
Homogenizuj tkankę za pomocą dużego tłuczka, a następnie małego tłuczka, aby rozbić tkankę i uwolnić białka wewnątrzkomórkowe, w tym α-synukleinę.
Przenieść homogenat do probówki i odwirować. Zebrać supernatant zawierający białko i rozcieńczyć go buforem.
Dodaj ten supernatant do mikropłytki pokrytej przeciwciałami specyficznymi dla α-synukleiny, wstępnie potraktowanej środkiem blokującym, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu.
Inkubować z mieszaniem, umożliwiając wiązanie się normalnej i zmutowanej α-synukleiny.
Umyć płytkę, a następnie dodać przeciwciała wykrywające specyficzne dla zmutowanej α-synukleiny i inkubować z mieszaniem.
Ponownie umyć i dodać przeciwciała związane z enzymami, a następnie inkubować pod wpływem mieszania.
Dodaj substrat i inkubuj w ciemności pod mieszaniem. Substrat reaguje z enzymem, powodując zmianę koloru.
Zatrzymaj reakcję z kwasem i zmierz absorbancję, aby określić ilościowo zmutowaną α-synukleinę.
Aby przygotować homogenaty mózgu, dodaj odpowiednią objętość buforu HS do wypreparowanych obszarów mózgu, aby osiągnąć oczekiwany procent homogenatu, jak pokazano w poniższej tabeli. Za pomocą młynka do tkanek składającego się z rurki ze szkła borokrzemianowego i dwóch tłuczków, A i B, wlej do probówki obszar mózgu, który ma zostać zmiażdżony. A następnie za pomocą tłuczka A homogenizuj tkankę 10 razy, aby ją zdysocjować.
Następnie przełącz się na tłuczek B i homogenizuj dodatkowe 20 razy. Za pomocą pipety transferowej przenieś homogenat do probówki o pojemności 1,5 mililitra, powtarzając homogenizację z pozostałymi próbkami mózgu. Odwirować próbki o masie 1000 g przez pięć minut, w temperaturze czterech stopni Celsjusza. A następnie zbierz supernatanty i podziel je na podwielokrotności o pojemności 200 mikrolitrów.
Za pomocą 100 mikrolitrów roztworu powlekającego przeciwciała pokryj dołki 96 mikropłytek dołkowych i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia dodaj 300 mikrolitrów PBST do studzienek i użyj myjki do talerzy, aby umyć płytki pięć razy. Pracując w temperaturze pokojowej, idąc dalej, dodaj 200 mikrolitrów buforu blokującego T20 PBS do każdej studzienki i potrząsaj płytkami z prędkością 150 obr./min przez godzinę przed użyciem PBST do pięciokrotnego umycia płytek.
Stosując PBST, 1% BSA, rozcieńczyć homogenaty mózgu, postępując zgodnie z wytycznymi wymienionymi tutaj. I dodaj 100 mikrolitrów do każdej studzienki. Następnie inkubować w temperaturze pokojowej i 150 obr./min przez dwie godziny przed użyciem PBST do pięciokrotnego umycia płytek.
Po ostatnim płukaniu dodać niezbędne przeciwciała wykrywające alfa synukleinę rozcieńczone w PBST i 1% BSA, jak podano w tabeli drugiej protokołu tekstowego. Inkubować w temperaturze pokojowej i 150 obr./min przez godzinę przed umyciem płytek pięć razy, tak jak poprzednio.
Następnie dodać anty-mysie lub anty-królicze koniugaty IGG HRP rozcieńczone do 1 do 8,000 w PBST, 1% BSA. I inkubować z prędkością 150 obr./min przez godzinę przed pięciokrotnym umyciem płytek. Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu TMB do każdej studzienki i inkubuj z prędkością 150 obr./min przez 15 minut w ciemności. Zatrzymaj reakcję, dodając 100 mikrolitrów jednego normalnego kwasu solnego na studzienkę. Następnie użyj czytnika mikropłytek, aby zmierzyć absorbancję przy 450 nanometrach.