Wykrywanie białka α-synukleiny związanego z chorobą neurodegeneracyjną za pomocą testu ELISA

0 wyświetleń4:37 min • April 28th, 2025

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zacznij od tkanki mózgowej transgenicznej myszy z nadekspresją zmutowanej α-synukleiny, nieprawidłowo sfałdowanego białka neuronalnego związanego z chorobą neurodegeneracyjną, zanurzonej w buforze o wysokiej zawartości soli.

Homogenizuj tkankę za pomocą dużego tłuczka, a następnie małego tłuczka, aby rozbić tkankę i uwolnić białka wewnątrzkomórkowe, w tym α-synukleinę.

Przenieść homogenat do probówki i odwirować. Zebrać supernatant zawierający białko i rozcieńczyć go buforem.

Dodaj ten supernatant do mikropłytki pokrytej przeciwciałami specyficznymi dla α-synukleiny, wstępnie potraktowanej środkiem blokującym, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu.

Inkubować z mieszaniem, umożliwiając wiązanie się normalnej i zmutowanej α-synukleiny.

Umyć płytkę, a następnie dodać przeciwciała wykrywające specyficzne dla zmutowanej α-synukleiny i inkubować z mieszaniem.

Ponownie umyć i dodać przeciwciała związane z enzymami, a następnie inkubować pod wpływem mieszania.

Dodaj substrat i inkubuj w ciemności pod mieszaniem. Substrat reaguje z enzymem, powodując zmianę koloru.

Zatrzymaj reakcję z kwasem i zmierz absorbancję, aby określić ilościowo zmutowaną α-synukleinę.

Aby przygotować homogenaty mózgu, dodaj odpowiednią objętość buforu HS do wypreparowanych obszarów mózgu, aby osiągnąć oczekiwany procent homogenatu, jak pokazano w poniższej tabeli. Za pomocą młynka do tkanek składającego się z rurki ze szkła borokrzemianowego i dwóch tłuczków, A i B, wlej do probówki obszar mózgu, który ma zostać zmiażdżony. A następnie za pomocą tłuczka A homogenizuj tkankę 10 razy, aby ją zdysocjować.

Następnie przełącz się na tłuczek B i homogenizuj dodatkowe 20 razy. Za pomocą pipety transferowej przenieś homogenat do probówki o pojemności 1,5 mililitra, powtarzając homogenizację z pozostałymi próbkami mózgu. Odwirować próbki o masie 1000 g przez pięć minut, w temperaturze czterech stopni Celsjusza. A następnie zbierz supernatanty i podziel je na podwielokrotności o pojemności 200 mikrolitrów.

Za pomocą 100 mikrolitrów roztworu powlekającego przeciwciała pokryj dołki 96 mikropłytek dołkowych i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia dodaj 300 mikrolitrów PBST do studzienek i użyj myjki do talerzy, aby umyć płytki pięć razy. Pracując w temperaturze pokojowej, idąc dalej, dodaj 200 mikrolitrów buforu blokującego T20 PBS do każdej studzienki i potrząsaj płytkami z prędkością 150 obr./min przez godzinę przed użyciem PBST do pięciokrotnego umycia płytek.

Stosując PBST, 1% BSA, rozcieńczyć homogenaty mózgu, postępując zgodnie z wytycznymi wymienionymi tutaj. I dodaj 100 mikrolitrów do każdej studzienki. Następnie inkubować w temperaturze pokojowej i 150 obr./min przez dwie godziny przed użyciem PBST do pięciokrotnego umycia płytek.

Po ostatnim płukaniu dodać niezbędne przeciwciała wykrywające alfa synukleinę rozcieńczone w PBST i 1% BSA, jak podano w tabeli drugiej protokołu tekstowego. Inkubować w temperaturze pokojowej i 150 obr./min przez godzinę przed umyciem płytek pięć razy, tak jak poprzednio.

Następnie dodać anty-mysie lub anty-królicze koniugaty IGG HRP rozcieńczone do 1 do 8,000 w PBST, 1% BSA. I inkubować z prędkością 150 obr./min przez godzinę przed pięciokrotnym umyciem płytek. Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu TMB do każdej studzienki i inkubuj z prędkością 150 obr./min przez 15 minut w ciemności. Zatrzymaj reakcję, dodając 100 mikrolitrów jednego normalnego kwasu solnego na studzienkę. Następnie użyj czytnika mikropłytek, aby zmierzyć absorbancję przy 450 nanometrach.

09:27

Sekwencyjna ekstrakcja rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej alfa-synukleiny z mózgów parkinsonowskich

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

09:32

Obrazowanie bioluminescencyjne zapalenia układu nerwowego u myszy transgenicznych po obwodowej inokulacji włókien alfa-synukleiny

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

09:44

Wytwarzanie włókienek preformowanych alfa-synukleiną z monomerów i stosowanie in vivo

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

01:30

Wykrywanie fosforylowanej alfa-synukleiny za pomocą Western Blotting

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

04:09

Test immunofluorescencyjny do wykrywania agregatów alfa-synukleiny w sekcji biopsji skóry

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

03:25

Barwienie immunologiczne neuronów traktowanych agregatami alfa-synukleiny

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

12:01

Wykrywanie białka α-synucleiny związanego z chorobą za pomocą ulepszonego testu ELISA w mózgu transgenicznych myszy nadmiernie ekspresujących ludzkie α-synucleinę z mutacją A53T

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

07:08

Wysokoprzepustowy, multipleksowany i ukierunkowany test proteomiczny, płyn mózgowo-rdzeniowy do ilościowego określania biomarkerów neurodegeneracyjnych i statusu izoform apolipoproteiny E

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

09:16

Egzogenne podawanie agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami do neuronów pierwotnych jako potężny model komórkowy tworzenia włókienek

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

08:33

Celowanie w agregaty alfa synukleiny w obwodowych włóknach nerwowych skóry za pomocą swobodnego testu immunofluorescencji

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

Ostatnia aktualizacja: 22 sierpnia 2026