Analiza LC-MS/MS profilu proteomicznego granulek neuromelaniny wyizolowanych z ludzkiej tkanki mózgowej

Zacznij od peptydów pochodzących z granulek neuromelaniny (NMG) wyizolowanych z pośmiertnej ludzkiej tkanki mózgowej.

NMG, znajdujące się w neuronach produkujących dopaminę, zawierają pigment neuromelaniny, białka i lipidy.

Weź kolumnę do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) zawierającą fazę stacjonarną na bazie krzemionki funkcjonalizowaną hydrofobowymi ligandami.

Załaduj peptydy do kolumny.

Peptydy hydrofobowe wiążą się z kolumną silniej niż hydrofilowe.

Przepuść bufor elucji przez kolumnę.

Mniej hydrofobowych peptydów wymywa się najpierw, podczas gdy więcej hydrofobowych wymywa się później.

Zdeluzowane peptydy wchodzą do źródła jonizacji elektrorozpylania spektrometru mas, gdzie są jonizowane do naładowanych jonów peptydowych.

Zjonizowane peptydy następnie trafiają do analizatora masy, gdzie są rozdzielane na podstawie ich stosunku masy do ładunku.

Wybrany jon peptydowy jest kierowany do komórki zderzeniowej i rozdrabniany na mniejsze jony, których stosunek masy do ładunku jest ponownie mierzony.

Na koniec, dane są porównywane z referencyjną bazą danych w celu zidentyfikowania białek obecnych w próbce NMG.

Po przeprowadzeniu trawienia tryptycznego, jak opisano w tekście, przygotuj próbkę do analizy HPLC-MS, rozpuszczając od 200 do 400 nanogramów peptydów próbki w określonej objętości 0,1% TFA w inertnych wlotach szklanych fiolek ze spektrometrią mas. Jeśli oznaczanie stężenia nie ma zastosowania ze względu na małą ilość próbki, należy sprawdzić identyczne obciążenie próbki, porównując całkowity prąd jonów.

Aby rozpocząć proteomiczną analizę surowych danych, kliknij przycisk Załaduj, aby załadować surowe pliki do oprogramowania. Kliknij pozycję Ustaw eksperyment, aby przypisać nazwy próbek. Aby zdefiniować parametry specyficzne dla grupy, dodaj modyfikacje, wybierając Deamidation NQ, Oxidation M i Carbaminomethylation N-Term jako modyfikacje zmiennych. A następnie dodaj karbaminometylację C jako ustaloną modyfikację. Wybierz trypsynę jako enzym trawiący w zakładce trawienie.

W zakładce Kwantyfikacja bez etykiet. Dodaj opcję, LFQ. A jeśli do przetworzenia ma być więcej niż 10 plików, wybierz opcję szybkiego LFQ, aby skrócić czas przetwarzania. Upewniając się, że wszystkie inne parametry specyficzne dla grupy pozostają w ustawieniach fabrycznych, przejdź do zakładki Parametry globalne i dodaj plik FASTA pochodzący z uniprot.org na karcie Sekwencje. Zmodyfikuj odpowiednio regułę identyfikatora i dodaj identyfikator taksonomii 9606 dla Homo sapiens.

Do kwantyfikacji białek wybierz unikalne i brzytwy peptydy. Następnie dodaj opcję iBAQ jako miarę do oznaczania ilościowego białka na karcie Kwantyfikacja bez etykiet. Upewnij się, że wszystkie inne parametry globalne pozostają w ustawieniach fabrycznych i kliknij Start. Po pomyślnym przeprowadzeniu analizy pobierz .txt dane wyjściowe grupy białkowej.