JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:01 min. • April 28th, 2025
Rozpocznij od wielodołkowej płytki o płaskim dnie pokrytej matrycą błony podstawnej, która zawiera zewnątrzkomórkowy polimer i białka adhezyjne, które naśladują macierz mikrośrodowiska guza.
Wprowadź podłoże zawierające neurosferę komórek glejaka pochodzących z guza mózgu u dzieci, upewniając się, że jest ona umieszczona centralnie w studzience.
Matryca sprzyja przywiązaniu neurosfery do studni.
Dodaj odczynnik tłumiący tło, aby zminimalizować niespecyficzną fluorescencję.
Następnie wprowadź zielone przeciwciała anty-CD44 sprzężone z fluoroforem.
Przenieś płytkę do systemu obrazowania żywych komórek umieszczonego w inkubatorze, który utrzymuje fizjologiczne warunki komórki.
Z biegiem czasu komórki glejaka wyrażają białko adhezyjne CD44, które oddziałuje z białkami adhezyjnymi.
To aktywuje szlak sygnalizacji komórkowej i ułatwia migrację komórek z neurosfery.
Przeciwciała anty-CD44 sprzężone z fluoroforem wiążą się z ekspresją CD44 na komórkach glejaka, powodując ich fluoryzację.
Pojawienie się zielonych komórek fluorescencyjnych oddalających się od neurosfery potwierdza migrację komórek glejaka.
Gdy studzienki są pokryte BMM, wytnij końcówkę P200. Weź 50 mikrolitrów pożywki komórkowej i NS z każdej wybranej studzienki i przenieś ją do pokrytego, płaskiego dołka dennego. Sprawdź wizualnie obecność i położenie NS w każdej studzience. Delikatnie dodaj 50 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała BSR i ALR do każdej studzienki, czekając od dwóch do trzech minut, aby odczynniki się wymieszały. Używając odwróconego mikroskopu, upewnij się, że większość replikatów NS znajduje się centralnie w studni. Po upewnieniu się, że nie ma żadnych pęcherzyków, delikatnie przenieś płytkę do przyrządu do analizy żywych komórek, jak pokazano wcześniej.
W oprogramowaniu do analizy żywych komórek wybierz opcję Zaplanuj pozyskiwanie. Następnie kliknij zakładkę plusa i wybierz opcję Skanuj zgodnie z harmonogramem, aby zeskanować płyty z odstępami czasu, jak wspomniano w rękopisie tekstowym. W oknie oprogramowania utwórz lub przywróć naczynie, a następnie kliknij opcję Nowy. Wybierz typ skanowania Klonowanie rozcieńczenia, obiektyw 4X oraz fazę i kolor zielony dla testu migracji. Wybierz typ płyty i zdefiniuj studnie, które mają zostać zeskanowane, podświetlając je na mapie płyty. Następnie skonfiguruj częstotliwość skanowania. Kliknij Dodaj do harmonogramu i rozpocznij skanowanie.