Wykrywanie fosforylowanego neuronalnego kotransportera chlorku potasu 2 za pomocą Western Blotting

Weź lizat komórkowy zawierający kotransporter chlorku potasu 2 lub białka KCC2, które regulują poziom chlorków w neuronach.

Fosforylacja w miejscach regulatorowych zakłóca funkcję KCC2, modulując aktywność neuronalną.

Dodaj lizat do kulek sprzężonych z przeciwciałami skierowanymi do fosforylowanego KCC2. Inkubować, aby umożliwić wiązanie, a następnie umyć, aby usunąć niezwiązane białka i resztki komórkowe.

Potraktuj buforem denaturującym w wysokiej temperaturze, aby uwolnić KCC2, a następnie odwiruj, aby oddzielić kulki.

Załaduj supernatant zawierający KCC2 na żel do elektroforezy. Podziel białka na pasma, aby potwierdzić obecność fosforylowanego KCC2.

Przenieś prążki na membranę, a następnie inkubuj w roztworze blokującym, aby zamaskować niespecyficzne miejsca wiązania.

Inkubuj z pierwszorzędowymi przeciwciałami skierowanymi na fosforylowane KCC2.

Umyj, a następnie inkubuj z przeciwciałami drugorzędowymi znakowanymi enzymatami, aby oznaczyć przeciwciała pierwszorzędowe.

Umyj ponownie, a następnie dodaj substrat chemiluminescencyjny, który reaguje z enzymem, tworząc światło.

Zmierz natężenie światła, aby określić ilościowo fosforylowany KCC2 w lizacie.

Pobrać pipetą 300 mikrolitrów sefarozy białka G do probówki do mikrowirówki. Następnie odwirować roztwór o sile 500 G przez dwie minuty. Po odrzuceniu supernatantu dodać 500 mikrolitrów PBS i dobrze odwirować. Po odwirowaniu odrzucić supernatant i powtórzyć ten krok.

Następnie wymieszaj 1 miligram przeciwciał anty-KCC2 treoniny 906 i anty-KCC2 treoniny 1007 z 200 mikrolitrami granulek sefarozy białka G, zanim uzupełnisz objętość do 500 mikrolitrów za pomocą PBS. Po potrząsaniu na platformie wibracyjnej lub obracaniu koła przez dwie godziny w temperaturze 4 stopni Celsjusza, powtórz dwa prania z PBS.

Przeprowadź kwantyfikację białek na lizatach komórkowych i dodaj 1 miligram lizatu komórkowego do umytych kulek i inkubuj w rotatorze od końca do końca przed odwirowaniem. Wykonać trzy przemycia PBS zawierającym 150 milimolowy chlorek sodu, a następnie trzy przepłuczenia 200 mikrolitrami PBS przed ponownym zawieszeniem końcowej osadki w 100 mikrolitrach buforu do próbek LDS.

Potrząsaj rurkami w rotorze w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Inkubować je w bloku grzewczym i odwirować przed użyciem supernatantu do ładowania żelu. Zmontuj aparat do odlewania western blot i wlej świeżo przygotowany 8% żel separacyjny, aby odlać żel, pozostawiając około 2 centymetry wolnej przestrzeni od górnej części szkła odlewniczego. Dodaj 200 mikrolitrów absolutnego izopropanolu do zestawu i pozostaw w temperaturze pokojowej na 60 minut.

Usuń izopropanol za pomocą pipety i ostrożnie spłucz żel około 200 mikrolitrami wody destylowanej. Po dodaniu świeżo przygotowanego 6% żelu do układania w stosy do zestawu odlewniczego, delikatnie wpasuj grzebień do studzienki i pozostaw w temperaturze pokojowej na 30 minut. Następnie umieść odlany żel w zbiorniku do elektroforezy.

Po przelaniu buforu do zbiornika, załaduj 5 mikrolitrów markera masy cząsteczkowej do pierwszej studzienki i taką samą ilość białka do każdej studzienki żelu SDS-PAGE. Napełnij puste studzienki LDS i uruchom żel przez około 90 do 120 minut przy napięciu 120 woltów. Ponownie uwodnić membranę nitrocelulozową buforem transferowym zawierającym 20% metanolu.

Spłucz żel i membranę buforem transferowym i delikatnie rozprowadź je na stosie do przygotowania. Ułóż kanapkę do przeniesienia w tej kolejności, elektroda ujemna, pianka warstwowa, bibuła filtracyjna, spłukany żel SDS-PAGE, przepłukana membrana nitrocelulozowa, bibuła filtracyjna, pianka warstwowa, elektroda dodatnia. Po zakończeniu ułóż zmontowaną kanapkę w zbiorniku transferowym i pracuj pod napięciem 90 V przez 90 minut lub 30 V przez 360 minut.

Zablokuj suchą membranę na 1 godzinę w temperaturze pokojowej za pomocą bufora blokującego. Inkubować błony z odpowiednimi rozcieńczeniami pierwszorzędowego przeciwciała i beta-aktyny w buforze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnie podaj trzy przemycia TBST przez 5 minut każde.

Inkubuj przemytą membranę z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w buforze blokującym przez 60 minut i powtórz trzy płukania TBST. Po zakończeniu umieść umytą membranę na tablicy obrazowej. Aby opracować sygnały, rozprowadź przygotowany roztwór, mieszając równe objętości każdego wzmocnionego odczynnika chemiluminescencyjnego na membranie, przed przeniesieniem płytki obrazowania do systemu obrazowania w celu obrazowania.