JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 5:25 min. • April 28th, 2025
Weź lizat komórkowy zawierający kotransporter chlorku potasu 2 lub białka KCC2, które regulują poziom chlorków w neuronach.
Fosforylacja w miejscach regulatorowych zakłóca funkcję KCC2, modulując aktywność neuronalną.
Dodaj lizat do kulek sprzężonych z przeciwciałami skierowanymi do fosforylowanego KCC2. Inkubować, aby umożliwić wiązanie, a następnie umyć, aby usunąć niezwiązane białka i resztki komórkowe.
Potraktuj buforem denaturującym w wysokiej temperaturze, aby uwolnić KCC2, a następnie odwiruj, aby oddzielić kulki.
Załaduj supernatant zawierający KCC2 na żel do elektroforezy. Podziel białka na pasma, aby potwierdzić obecność fosforylowanego KCC2.
Przenieś prążki na membranę, a następnie inkubuj w roztworze blokującym, aby zamaskować niespecyficzne miejsca wiązania.
Inkubuj z pierwszorzędowymi przeciwciałami skierowanymi na fosforylowane KCC2.
Umyj, a następnie inkubuj z przeciwciałami drugorzędowymi znakowanymi enzymatami, aby oznaczyć przeciwciała pierwszorzędowe.
Umyj ponownie, a następnie dodaj substrat chemiluminescencyjny, który reaguje z enzymem, tworząc światło.
Zmierz natężenie światła, aby określić ilościowo fosforylowany KCC2 w lizacie.
Pobrać pipetą 300 mikrolitrów sefaroz
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych