JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:06 min. • April 28th, 2025
Weźmy chemicznie utrwaloną siatkówkę wyizolowaną z oka szczura.
Oko wykazuje wywołane ciepłem uszkodzenie rąbkowego splotu naczyniowego, sieci naczyń krwionośnych otaczających rogówkę.
To uszkodzenie blokuje drenaż płynów, zwiększając ciśnienie wewnątrzgałkowe (IOP) i powodując zwyrodnienie komórek zwojowych siatkówki (RGC).
Traktuj siatkówkę roztworem do przepuszczalności, aby przeniknąć komórkę i błony jądrowe.
Zastosuj roztwór blokujący, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał.
Usuń rozwiązanie blokujące.
Wprowadź pierwotne przeciwciała, które celują w czynnik transkrypcyjny głównie wyrażany w RGC.
Umyć, aby usunąć niezwiązane przeciwciała.
Wprowadź przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforem, które wiążą się z przeciwciałami pierwszorzędowymi.
Umyć, aby usunąć niezwiązane przeciwciała.
Przeciwbarwić jądra barwnikiem wiążącym DNA.
Umyj siatkówkę i zamontuj ją na szkiełku podstawowym za pomocą odpowiedniego medium montażowego.
Wizualizuj siatkówkę pod mikroskopem epifluorescencyjnym.
Zmniejszona gęstość komórek w uszkodzonym oku w porównaniu do kontroli potwierdza zwyrodnienie RGC spowodowane zwiększonym IOP.
Po wyizolowaniu siatkówki, przenieś je do 24-dołkowej płytki hodowlanej zawierającej 1 mililitr PBS, trzymając wewnętrzną siatkówkę skierowaną do góry. Przepuszczalność tkanki poprzez przemycie 0,5% niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym rozcieńczonym w PBS. Następnie inkubuj tkankę w roztworze blokującym przez godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym potrząsaniem. Podczas inkubacji należy przygotować roztwór przeciwciała pierwotnego BRM 3A i przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Po zablokowaniu tkanki, inkubuj siatkówki w 200 mikrolitrach roztworu przeciwciała pierwotnego w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 72 godziny, delikatnie potrząsając. Następnie umyj chusteczkę PBS. Inkubować tkankę w 200 mikrolitrach roztworu przeciwciała drugorzędowego przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, a następnie z roztworem przeciwbarwiącym jądro przez 10 minut w celu barwienia jąder fluorescencyjnych.
Po trzech płukaniach PBS, przenieś siatkówkę na szklane szkiełko mikroskopowe za pomocą dwóch małych szczotek, trzymając stronę szklistą do góry. Ustaw kwadrant grzbietowej siatkówki do góry na szkiełku mikroskopowym. Na koniec nałóż 200 mikrolitrów środka montażowego zapobiegającego blaknięciu na szklane szkiełko nakrywkowe i umieść je na płasko zamontowanej siatkówce w celu analizy mikroskopowej. Pod konfokalnym mikroskopem epi-fluorescencyjnym przy użyciu obiektywu powiększającego 40 razy zbadaj płaskie mocowania, aby oszacować komórki zwojowe siatkówki.