Immunoprecypitacja chromatyny natywnej komórek neurosfery

Umieść komórki neurosfery w buforze zawierającym detergenty, wapń i inhibitory proteazy.

Detergent przenika do komórek, podczas gdy inhibitor dezaktywuje proteazy, aby zachować białko docelowe związane z chromatyną.

Dodaj nukleazę i inkubuj. Nukleaza wykorzystuje wapń do trawienia chromatyny.

Dodaj bufor zawierający EDTA, który chelatuje wapń, inaktywując nukleazę.

Dodaj bufor do lizy komórek, uwalniając chromatynę.

Odwirować i zebrać supernatant.

Dodać przeciwciała specyficzne dla białka docelowego i inkubować z rotacją. Odwirować i usunąć supernatant.

Wprowadzić kulki magnetyczne skierowane do przeciwciała i inkubować z rotacją.

Dodaj bufor do lizy, aby oddzielić niespecyficznie związane DNA.

Magnetycznie uchwyć kulki i usuń supernatant.

Dodaj bufor o wysokiej zawartości soli, aby oddzielić niespecyficznie związane białka.

Magnetycznie uchwyć kulki i usuń supernatant.

Dodaj bufor stabilizacyjny, magnetycznie wychwytuj kulki i usuwaj zanieczyszczenia.

Ponownie zawiesić w buforze proteinazy-K w celu strawienia białek, uwalniając DNA.

Po zebraniu neurosfer odwiruj 1 razy 10 do 6 komórek neurosfery na immunoprecypitację w ilości 300 razy g przez 5 minut. Po odwirowaniu zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad neurosfery w jednym mililitrze zbilansowanego roztworu soli. Przenieś zawiesinę do 1,5-mililitrowych probówek mikrowirówkowych o niskiej wiązalności białka, a następnie odwiruj jak poprzednio.

Następnie zdekantuj supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy w 95 mikrolitrach buforu trawiennego uzupełnionego od 1 do 100 koktajlem inhibitorów proteazy na 1 razy 10 do 6 komórek. Natychmiast odpipetuj komórki w górę i w dół, aby zapobiec zbrylaniu się i tworzeniu pęcherzyków. Następnie wymieszaj 5 mikrolitrów 0,1x nukleazy mikrokokowej i 145 mikrolitrów buforu wytrawiającego i dodaj 5 mikrolitrów rozcieńczonej nukleazy mikrokokowej na 1 razy 10 do 6 komórek. Przesuń probówkę, aby wymieszać i umieść probówkę w bloku grzewczym o temperaturze 37 stopni Celsjusza dokładnie na 12 minut.

Trawienie nukleazy mikrokokowej w celu fragmentacji chromatyny jest najbardziej krytycznym krokiem. Właściwa fragmentacja chromatyny jest ważna dla osiągnięcia wysokiej rozdzielczości dla ChIP. Aby upewnić się, że ten krok zakończy się sukcesem, inkubuj wiele próbek pojedynczo, aby upewnić się, że nie dojdzie do nadmiernego trawienia.

Po 12 minutach dodaj 10 mikrolitrów 10x bufor zatrzymujący nukleazę mikrokokową na 1 razy 10 do 6 komórek. Począwszy od tego momentu, próbki muszą być przechowywane na lodzie. Analiza biologiczna próbki strawionej przez nukleazę mikrokokową pokazuje, że większość DNA została podzielona na mono, di i trinukleosomy. Następnie dodaj 110 mikrolitrów 2x buforu RIPA uzupełnionego od 1 do 100 koktajlem inhibitorów proteazy na 1 razy 10 do 6 komórek.

Przesuń probówkę, aby wymieszać, a następnie odwiruj przez 15 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza i 1,700 razy g. Przenieś supernatant zawierający chromatynę do zwykłej probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra i umieść na lodzie. Użyj buforu RIPA uzupełnionego inhibitorami proteazy w stężeniu od 1 do 1,000, aby rozcieńczyć chromatynę tak, aby każdy IP miał objętość od 100 do 200 mikrolitrów. Następnie należy usunąć podwielokrotność odpowiadającą 10% objętości ChIP jako próbkę wejściową.

Przygotuj dane wejściowe, dodając 100 mikrolitrów buforu TE uzupełnionego proteinazą-K i inkubuj w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez godzinę. Po oczyszczeniu wkładu za pomocą zestawu do oczyszczania PCR, zmierz stężenie wejścia za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego. Zapisz wyniki w notesie. Dodaj 10 mikrolitrów przemytych kulek magnetycznych białka A i G na IP, które zostaną wykonane na każdej próbce i inkubuj przez godzinę w temperaturze 4 stopni Celsjusza z obrotem przy 20 obr./min.

Umieść próbkę na uchwycie magnetycznym i pozwól koralikom się rozdzielić. Następnie przenieś wymaganą objętość do nowych probówek o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj pożądane przeciwciało do każdej probówki, a następnie owiń nakrętki plastikową folią parafinową, aby uniknąć parowania. Próbki inkubować przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza z rotacją jak poprzednio. Następnego dnia obracaj rurki z prędkością 2000 razy g przez 10 sekund. Następnie dodaj 10 mikrolitrów kulek do każdego IP i inkubuj przez trzy godziny w temperaturze 4 stopni Celsjusza z obrotem z prędkością 20 obr./min.

Następnie umieść próbki na magnetycznym stojaku i pozwól, aby kulki magnetyczne się rozdzieliły. Użyć pipety, aby usunąć supernatant. Następnie dodaj 150 mikrolitrów buforu RIPA z inhibitorami proteazy do każdego IP i inkubuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza przy 20 obr./min przez 5 minut. Po okresie inkubacji umieść próbki na stojaku magnetycznym i pozwól kulkom magnetycznym oddzielić się. Użyć pipety, aby usunąć supernatant. Następnie dodaj 150 mikrolitrów buforu chlorku litu uzupełnionego inhibitorami proteazy w niskim stężeniu do każdego IP i inkubuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza z rotacją przy 20 obr./min przez 5 minut.

Po okresie inkubacji umieść próbki na magnetycznym stojaku i pozwól kulkom magnetycznym się rozdzielić. Następnie użyj pipety, aby usunąć supernatant. Następnie dodaj 150 mikrolitrów zimnego TE bez inhibitorów proteazy do kulek i inkubuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza z rotacją z prędkością 20 obr./min przez 5 minut. Po ostatnim etapie płukania ponownie zawiesić próbkę w 100 mikrolitrach buforu TE uzupełnionego końcowym stężeniem 0,5 miligrama na mililitr proteinazy-K i inkubować w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez godzinę.