Wykonywanie podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ w celu wykrycia ekspresji genów w skrawkach mózgu myszy
JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 4:06 min. • April 28th, 2025
Weźmy chemicznie utrwalony wycinek mózgu myszy.
Dodać mieszaninę hybrydyzacyjną zawierającą czynnik permeabilizacyjny i sondy RNA znakowane FITC lub DIG.
Inkubować, aby umożliwić przenikanie komórek i wejście sondy.
Sondy wiążą się z komplementarnymi sekwencjami na mRNA MBP, markerze referencyjnym wszechobecnym wyrażanym w oligodendrocytach lub mRNA ASPA, celu.
Umyć, aby usunąć niezwiązane sondy.
Dodaj bufor blokujący, aby zapobiec wiązaniu się przeciwciał nieswoistych.
Wprowadzić przeciwciała anty-FITC sprzężone z HRP skierowane na sondę znakowaną FITC.
Umyć, a następnie dodać FITC-tyramide.
HRP utlenia tyramid FITC do wysoce reaktywnej formy, która wiąże się z pobliskimi białkami, wzmacniając sygnał fluorescencyjny.
Umyj i ponownie wprowadź bufor blokujący.
Dodaj przeciwciała anty-DIG sprzężone z fosfatazą alkaliczną skierowane na sondę znakowaną DIG.
Umyj i nałóż roztwór Fast Red.
Fosfataza alkaliczna defosforyluje Fast Red, wytwarzając fluorescencyjny osad.
Wizualizacja pod mikroskopem fluorescencyjnym.
Kolokalizacja sygnałów Mbp i ASPA wskazuje na ekspresję ASPA w oligodendrocytach.
Rozcieńczyć dwie sondy w buforze hybrydyzacyjnym, wstępnie podgrzanym do 65 stopni Celsjusza i dobrze wymiesz
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych