Komórkowy test wapniowy do średnio- i wysokoprzepustowych badań przesiewowych funkcji kanałów TRP przy użyciu FlexStation 3

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie zastosowania Flex Station 3 do badania profilu farmakologicznego przejściowego potencjału receptora lub wyzwolenia jednego kanału. Osiąga się to poprzez pierwsze przygotowanie komórek, które ekspresowo wyłączają jeden kanał w 96. Cóż, płytki do mikromiareczkowania.

Po umyciu komórek w myjce do mikropłytek, komórki są ładowane wrażliwym na wapń barwnikiem fluorescencyjnym. Grypa o 4:00 rano, po okresie ładowania komórek następuje kilka dodatkowych prań. Kolejnym krokiem procedury jest przygotowanie płytki złożonej, w tym trip, jeden agonista i domniemany trip, jeden antagonista.

Ostatnim krokiem jest ustawienie parametrów oprogramowania do odczytu płytek w systemie Flex Station three. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują zależności między dawką a reakcją na aktywację tripu A przez kwas fonemowy grypy i hamowanie przez związek antagonistyczny A Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w 21 mechanizmów aktywacji poprzez pomiar napływu wapnia. Może być również stosowany do badania funkcji innych przepuszczalnych dla wapnia kanałów ocznych i głębokich receptorów sprzężonych z białkami przy użyciu wrażliwych na wapń mrożonych barwników lub barwników o małym potencjale.

Główną zaletą tej taktyki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak obrazowanie wapnia i ręczne mapowanie plastrów, jest to, że ta technika oszczędzająca czas zapewnia wysokoprzepustowe badania przesiewowe pod kątem funkcji i modulacji formuły wapniowej, kanałów żelazowych i innych receptorów mobilizujących ca. Przed rozpoczęciem tego protokołu należy wyhodować HEC 2 93 komórki stabilnie transfekowane wyzwalaczem A do gęstości od 70 do 90%, jak opisano w pisemnym protokole. Aby rozpocząć przygotowanie komórek do testu wapnia, pokryj 96-dołkowe płytki, pipetując 50 mikrolitrów poli-L ornityny do każdego dołka, inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej 15 minut.

Po inkubacji przepłukać komórki raz solą fizjologiczną buforowaną fosforanem KO Po trypsynie komórki HEC 2 93 przenoszą pożądaną ilość komórek do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i wirówki. Próbka. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić powstałą osad komórkowy.

W pożywce hodowlanej DMEM uzupełnionej 10% inaktywowaną płodową surowicą bydlęcą inaktywowaną ciepłem dozuje 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Używając pipetera wielokanałowego, pozostaw płytkę w okapie na co najmniej 30 minut przed umieszczeniem jej w nawilżanym inkubatorze do hodowli komórkowych na 20 do 44 godzin. Do przygotowania testu wapnia należy najpierw przygotować roztwory zgodnie z opisem w pisemnym protokole.

Po przygotowaniu wymieszaj 10 mikrolitrów jednomilimolowej grypy o 4:00 rano z 10 mikrolitrami oniku. F1 27, przenieś całą zawartość do pięciu mililitrów grypy. Oh cztery testowe uzupełnione 0,1% albuminą surowicy bydlęcej.

Następnie umyj komórki wyhodowane w 96. Płytki studzienkowe z HBSS w ilości 80 mikrolitrów na studzienkę dwa razy za pomocą myjki do mikropłytek, po umyciu dodać roztwór ładujący grypę o 4:00 rano w ilości 50 mikrolitrów na studzienkę za pomocą pipetera wielokanałowego i inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Podczas jednogodzinnego okresu ładowania komórek przygotuj serię trzech x roztworów agonistów, serię trzech x roztworów antagonisty i dużą objętość 300 mikromolowych agonistów w pipecie buforowej do testu grypy oh four.

300 mikrolitrów rozcieńczonych roztworów związków na 96-dołkową płytkę złożoną. W każdym przypadku, gdy jest to możliwe, należy zorganizować seryjne rozcieńczanie związku oraz odpowiadające mu kontrole dodatnie i ujemne w tej samej kolumnie płytki złożonej. Gdy stacja Flex 3 odczytuje pojedynczą kolumnę na raz, a następnie pipetuje 300 mikrolitrów 300 mikromolowego roztworu agonisty przylegającego do każdej studzienki zawierającej antagonistę jako ostatni etap przygotowania komórek.

Po ostatnim płukaniu przemyć załadowane komórki trzykrotnie buforem przeciw grypie lub czterokwasowości za pomocą myjki do mikropłytek. Pozostaw 80 mikrolitrów buforu przeciw grypie lub czterech kwasów w każdej studzience. Aby rozpocząć odczyt płyty, włącz system Flex Station three i uruchom oprogramowanie soft max Pro 5.2.

Zapisz eksperyment z nową nazwą pliku w konfiguracji. Wybierz tryb elastyczny i wprowadź parametry, aby zmierzyć efekt agonisty i antagonisty, zgodnie z listą w pisemnej procedurze. Następnie umieść nowe pudełko na końcówki, płytkę złożoną i płytkę odczytu w odpowiednich tacach stacji elastycznej. Trzy.

Rozpocznij odczyt płyty, klikając przycisk odczytu w oprogramowaniu Soft Max Pro. Stacja Flex 3 będzie odczytywać jedną kolumnę na raz i dodawać związki w zaprogramowanych punktach czasowych bez przerywania odczytu. Po zakończeniu przebiegu dane eksperymentalne mogą być przetwarzane bezpośrednio za pomocą oprogramowania Soft Max PRO lub kopiowane i wklejane do dowolnego programu do arkuszy kalkulacyjnych, takich jak Microsoft Excel.

Aby przeanalizować dane, wygeneruj krzywe stężenie-odpowiedź dla podróży, jednego agonisty kwasu fonemowego grypy, a dla domniemanego tripu jednego antagonisty związku a, używając najmniejszych kwadratów pasujących zgodnie z opisem w pisemnej procedurze podróży. Jednym z nich jest przepuszczalny dla wapnia kanał kationowy, którego aktywacja prowadzi do napływu wapnia, który może być wykryty przez wrażliwą na wapń grypę barwnikową o 4:00 rano. Reprezentatywne ślady przebiegu czasu do zmian fluorescencji w odpowiedzi na szereg stężeń kwasu fonemowego grypy lub FFA są pokazane przy wyższych stężeniach. FFA wywołało wzrost fluorescencji ze znacznie szybszą kinetyką niż przy niższych stężeniach, pomimo podobnych szczytowych poziomów fluorescencji.

Aby rozróżnić te różnice, skonstruowano zależność stężenie-odpowiedź, mierząc początkowe tempo wzrostu fluorescencji. Po dodaniu różnych stężeń FFA, połowę maksymalnego efektywnego stężenia FFA określono na 55,4 mikromola. Zależność stężenie-odpowiedź hamowania FFA wywołała odpowiedź wapniową przez przypuszczalne wyzwolenie jednego antagonisty związku A, jest również pokazany związek.

Dawka niezależnie zmniejszała odpowiedź jednej komórki podróży A na FFA przy połowie maksymalnego stężenia hamującego wynoszącym 4,3 mikromola. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać profile farmakologiczne potrójnego A jeden i powiązanych kanałów za pomocą stacji flagowej trzeciej.