Name: Komórkowy test wapniowy do średnio- i wysokoprzepustowych badań przesiewowych funkcji kanałów TRP przy użyciu FlexStation 3 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Poznaj komórkowy test wapniowy do badania profilu farmakologicznego kanałów TRPA1 przy użyciu FlexStation 3. Ta metoda umożliwia szybkie przesiewowe badanie modulacji kanałów w warunkach wysokoprzepustowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr. Johnowi Hancockowi, dr. Rayowi Grilloowi, dr. Andrew Morrisowi oraz dr Oldze Chumakovej za wsparcie. System FlexStation 3 jest częścią UTHSC Cytodynamic Imaging Facility. Dziękujemy również dr. Ardemowi Patapoutianowi oraz dr. Michaelowi Bandellowi ze Scripps Research Institute oraz Genomics Institute of the Novartis Research Foundation (GNF) za udostępnienie stabilnej linii komórkowej HEK293-hTRPA1. Badania są częściowo finansowane z grantów NIH (GM081658 dla MXZ), Texas Medical Center Digestive Diseases Center (dla HH) oraz Mission Connect/TIRR Foundation (dla HH).

1. Przygotowanie komórek w płytkach 96-dołkowych
Dla komórek HEK293 przejściowo transfektowanych cDNA ludzkiego TRPA1
<ol>
<li>Komórki HEK293 hoduje się przez jeden do dwóch dni w minimalnym niezbędnym medium Dulbecco (DMEM) zawierającym 4,5 mg/ml glukozy (Thermo Scientific, SH3002201), uzupełnionym o 10% inaktywowanej ciepłem płodowej surowicy bydlęcej (Invitrogen, 16000-044), 50 jednostek/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny (Invitrogen, 15140-163). W dniu transfekcji gęstość komórek powinna wynosić 70-90%.</li>
<li>Płytki 96-dołkowe powleka się, pipetując 50 μl poli-L-ornityny (Sigma P3655, 20 μg/ml w sterylnej wodzie destylowanej) do każdego dołka i inkubując w temperaturze 37°C przez co najmniej 15 min. Każdy dołek należy przepłukać raz solą fizjologiczną z buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS) bez Mg2+ i Ca2+ (Thermo Scientific, SH3002803). Płytkę można pozostawić w komorze do hodowli komórkowej na kilka godzin.</li>
<li>Dla każdego dołka płytki 96-dołkowej rozcieńcza się w probówce Eppendorf 1,5 ml 0,2 μg cDNA w 25 μl OPTI-MEM (Invitrogen, 31985-070). Ilość należy zwiększyć proporcjonalnie do liczby dołków, które zostaną poddane transfekcji tym samym cDNA. W osobnej probówce Eppendorf 1,5 ml należy również rozcieńczyć 0,4 μl Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668-019) w 25 μl OPTI-MEM dla każdego dołka przeznaczonego do transfekcji. Ilość należy zwiększyć zgodnie z całkowitą liczbą dołków do transfekcji.</li>
<li>Krótko wymieszaj na wirówce typu vortex rozcieńczone cDNA oraz Lipofectamine 2000 i pozostaw je w temperaturze pokojowej przez około 5 min.</li>
<li>Przenieś równą objętość rozcieńczonej Lipofectamine 2000 do probówki zawierającej rozcieńczone cDNA, wymieszaj na vortexie i pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej od 15 min do 2 h. W tym czasie przenieś mieszaninę cDNA/Lipofectamine 2000 w ilości 49 μl/dołek na płytkę powleczoną poli-L-ornityną.</li>
<li>Poddaj komórki HEK293 (Krok 1.1) trypsynizacji, zmierz gęstość komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek Countess (Invitrogen, C10227) i przenieś pożądaną liczbę komórek (zazwyczaj około ~125 000-150 000 komórek/dołek) do sterylnej probówki wirówkowej 15 ml z okrągłym dnem. Wirować przy 1000 x RPM przez 5 min. Resuspenduj komórki w stężeniu ~1 250 000-1 500 000 komórek/ml w medium hodowlanym DMEM, uzupełnionym o 10% inaktywowanej ciepłem płodowej surowicy bydlęcej, ale bez antybiotyków.</li>
<li>Rozdziel 98 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka zawierającego mieszaninę cDNA-Lipofectamine 2000, używając pipety wielokanałowej lub dozownika do mikropłytek MicroFill (Bio-Tek). Pozostaw płytkę w komorze przez co najmniej 30 min przed umieszczeniem jej w nawilżonym inkubatorze do hodowli komórkowej. Inkubuj w 37°C, 5% CO2 przez 20-44 h.</li>
</ol>
Dla komórek HEK293 stabilnie wykazujących ekspresję TRPA1
<ol start="8">
<li>Postępuj zgodnie z krokiem 1.2 w celu pokrycia płytek 96-dołkowych.</li>
<li>Indukowalna linia komórkowa HEK293-hTRPA1 została hojnie udostępniona przez dr A. Patapoutiana (The Scripps Research Institute) i hodowana w tym samym medium co komórki HEK293 typu dzikiego (Krok 1.1), lecz z dodatkiem 5 μg/ml blastycydyny (Invitrogen, A1113902) i 50 μg/ml hygromycyny B (Invitrogen, 10687010). Gdy gęstość komórek osiągnie około 90%, poddaj komórki trypsynizacji, policz gęstość komórek i odwiruj pożądaną ilość komórek przy 1000 x RPM przez 5 min. Resuspenduj komórki do gęstości ~1 000 000 komórek/ml w tym samym medium hodowlanym z dodatkiem doksycykliny (Fisher, BP26535, 0,25 μg/ml).</li>
<li>Rozdziel zawiesinę komórkową na płytki pokryte poli-L-ornityną w ilości 100 μl/dołek, używając pipety wielokanałowej lub urządzenia MicroFill (Bio-Tek). Pozostaw płytkę w komorze z laminarnym przepływem powietrza na co najmniej 30 min przed umieszczeniem jej w inkubatorze do hodowli komórkowych z nawilżeniem. Inkubuj w 37 °C, 5% CO2 przez 16 – 24 h.</li>
</ol>
2. Roztwory
<ol>
<li>W charakterze roztworu zewnątrzkomórkowego stosuje się buforowany roztwór soli Hanksa (HBSS). Zawiera on (w mM): 137 NaCl, 5,4 KCl, 0,25 Na2HPO4, 0,44 KH2PO4, 1,3 CaCl2, 1,0 MgSO4, 1,0 MgCl2, 10 glukozy, 10 HEPES, z pH dostrojonym do 7,4 przy użyciu 1N NaOH).</li>
<li>Bufor do analizy Fluo-4 zawiera 2 mM probenecydu w HBSS. Należy przygotować roztwór zapasowy probenecydu (Sigma, P8761) o stężeniu 250 mM w 0,5 N NaOH. Następnie rozcieńczyć go w HBSS w stosunku 1:125. Ponownie dostroić pH do 7,4 przy użyciu 1 N HCl.</li>
</ol>
3. Obciążanie komórek barwnikiem Fluo-4 AM
<ol>
<li>Rozpuścić 1 mg Fluo-4 AM (Invitrogen, F14202) w 912 μl bezwodnego DMSO, aby przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 1 mM. Roztwór zapasowy Fluo-4 AM można przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej miesiąc.</li>
<li>Zmieszać 10 μl 1 mM Fluo-4 AM z 10 μl Pluronic F-127 (Invitrogen, P3000MP, roztwór 20% (w/v) w DMSO), a następnie przenieść całą zawartość do 5 ml buforu do analizy Fluo-4 (Krok 2.2) uzupełnionego o 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (Sigma, A9418).</li>
<li>Przemyć komórki hodowane na płytkach 96-dołkowych (Krok 1.7 lub 1.10) za pomocą HBSS w objętości 80 μl/dołek, powtarzając czynność 2 razy przy użyciu myjki do mikropłytek (np. ELx405TM od Bio-Tek).</li>
<li>Dodać roztwór ładujący Fluo-4 AM (Krok 3.2) w objętości 50 μl/dołek, używając pipety wielokanałowej lub urządzenia MicroFill (Bio-Tek), a następnie inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 1 h.</li>
<li>Przemyć komórki 3 razy buforem do analizy Fluo-4 (Krok 2.2) za pomocą myjki do mikropłytek ELx405TM. Po ostatnim płukaniu pozostawić 80 μl buforu do analizy Fluo-4 w każdym dołku.</li>
</ol>
4. Przygotowanie płytki z związkami
<ol>
<li>Podczas godzinnego okresu ładowania komórek przygotować serię rozcieńczeń 3x agonistów (lub antagonistów) w stężeniu 3x pożądanego stężenia końcowego w buforze do testu Fluo-4.</li>
<li>Pipetować 250-300 μl rozcieńczonych roztworów związków do płytki 96-dołkowej na związki. W miarę możliwości rozmieścić rozcieńczenia seryjne danego związku oraz odpowiadające im kontrole pozytywną i negatywną w tej samej kolumnie płytki, ponieważ FlexStation 3 odczytuje jedną kolumnę na raz.</li>
</ol>
5. Odczyt płytek w systemie FlexStation 3
<ol>
<li>Włącz system (FlexStation 3, komputer oraz oprogramowanie SoftMax Pro 5.2)</li>
<li>Zapisz eksperyment pod nową nazwą pliku. W ustawieniach wybierz tryb FLEX i wprowadź następujące wartości:</li>
</ol>
Protokół nr 1, efekt agonisty 
<img src="/files/ftp_upload/3149/3149table1.jpg" alt="Parametry analizy fluorescencyjnej: długości fal, czułość, czas, typ płytki, przeniesienie związków." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Tabela 1">
Protokół nr 2, efekt antagonisty 
<img src="/files/ftp_upload/3149/3149table2.jpg" alt="Konfiguracja spektroskopowa; długości fal emisji/wzbudzenia; metoda analizy na płytce 96-dołkowej; proces analizy danych." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Tabela 2">
<ol start="3">
<li>Umieść nowe pudełko z końcówkami, płytkę z połączeniami oraz płytkę do odczytu w odpowiednich tackach urządzenia FlexStation 3 i kliknij przycisk „read”. FlexStation 3 odczyta jedną kolumnę na raz i doda związki w zaprogramowanych punktach czasowych, nie przerywając procesu odczytu. Odczyt jednej kolumny trwa około 3 min (5 min dla Protokołu nr 2), a urządzenie będzie kontynuować odczyt kolejnych kolumn, wykonując dodawanie związków zgodnie z zaprogramowanym przez użytkownika w kroku 5.2 schematem, aż do odczytania wszystkich kolumn.</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
<li>Dane eksperymentalne można przetwarzać bezpośrednio za pomocą oprogramowania SoftMax Pro 5.2 lub skopiować i wkleić do dowolnego programu arkusza kalkulacyjnego, takiego jak Microsoft Excel. Krzywą koncentracja-odpowiedź dla agonisty TRPA1, kwasu flufenamowego (FFA), konstruuje się przy użyciu następnego algorytmu dopasowania metodą najmniejszych kwadratów: <img src="/files/ftp_upload/3149/3149eq1.jpg" alt="Równanie dawka-odpowiedź; stosowane w farmakologii; wzór na skuteczność leku; opisuje krzywą sigmoidalną." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1">, gdzie Y to obserwowana odpowiedź, Ymax to znormalizowana odpowiedź maksymalna, C to odpowiadające stężenie leku, EC50 to stężenie wywołujące odpowiedź połowiczną, a nH to pozorny współczynnik Hilla. Krzywą koncentracja-hamowanie dla domniemanego antagonisty TRPA1, związku A, uzyskuje się stosując stałe stężenie FFA (100 μM) i stopniowo zwiększając stężenie związku A. Wartość IC50 związku A oblicza się poprzez dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów do następującego równania: <img src="/files/ftp_upload/3149/3149eq2.jpg" alt="Równanie dawka-odpowiedź; Y=Ymax/[1+(EC50/[Ant])^nH]; analiza farmakologiczna, dopasowanie danych." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2">, gdzie Y to obserwowana odpowiedź, Ymax to znormalizowany szczyt odpowiedzi, [Ant] to odpowiadające stężenie związku A, IC50 to stężenie antagonisty wywołujące połowiczne hamowanie odpowiedzi wywołanej przez FFA, a nH to pozorny współczynnik Hilla.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki:
TRPA1 jest przepuszczalnym dla Ca2+ kanałem kationowym, którego aktywacja prowadzi do napływu wapnia, który można wykryć za pomocą barwnika wrażliwego na Ca2+, Fluo-4 (1-2). Do badania zależności koncentracyjno-odpowiedzi agonistów i antagonistów TRPA1 wykorzystano stabilną linię komórkową HEK293-hTRPA1. Komórki załadowano barwnikiem Fluo-4 AM, umieszczono w 80 μl buforu do analizy i odczytano za pomocą systemu FlexStation 3. Po zarejestrowaniu fluorescencji bazowej przez 30 s, do komórek dodano za pomocą pipety wielokanałowej, stanowiącej część modułu płynowego FlexStation 3, 40 μl rozcieńczenia seryjnego agonisty TRPA1, FFA, w stężeniu 3x pożądanego stężenia końcowego. Zmiany fluorescencji monitorowano przez kolejne 180 s. Względne zmiany fluorescencji Fluo-4 dla każdej studzienki wyrażono jako ΔF= (F - F0), gdzie F i F0 to odpowiednio wartości fluorescencji w badanym czasie oraz na początku odczytu. Reprezentatywne przebiegi czasowe zmian fluorescencji w odpowiedzi na szereg stężeń FFA przedstawiono na Ryc. 1. Należy zauważyć, że dla ostatnich czterech stężeń FFA, choć maksymalne poziomy odpowiedzi są podobne, kinetyka aktywacji jest wyraźnie szybsza przy wyższych niż przy niższych stężeniach FFA. Dlatego, aby rozróżnić te różnice, zależność koncentracyjno-odpowiedź skonstruowano poprzez pomiar początkowych szybkości (nachylenia krzywej) wzrostu fluorescencji po dodaniu różnych stężeń FFA (Ryc. 2). Połowiczna maksymalna stężenie efektywne (EC50) FFA określono na 55,4 μM (n=3). Aby przetestować domniemanego antagonistę TRPA1, związek A, przeprowadzono podobny eksperyment zgodnie z protokołem nr 2 (Krok 2). W tym przypadku szereg rozcieńczeń antagonisty dodano w 30 s (40 μl stężeń 3x pożądanej wartości końcowej), a FFA dodano 180 s później (60 μl w stężeniu 300 μM dla końcowego stężenia 100 μM). Związek A w sposób zależny od dawki redukował odpowiedź komórek TRPA1 na FFA, a jego połowiczne maksymalne stężenie hamujące (IC50) wyniosło 4,3 μM (n=3) (Ryc. 2).
<img src="/files/ftp_upload/3149/3149fig1.jpg" alt="Wykres kinetyki enzymatycznej, ∆F w funkcji czasu, efekty stężenia substratu, analiza szybkości reakcji." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Zależna od stężenia aktywacja ludzkiego TRPA1 przez FFA. Krzywe przedstawiają wywołany przez FFA wzrost fluorescencji w czasie (pokazano jedynie odpowiedzi w ciągu pierwszych 60 s, aby lepiej zobrazować szybką kinetykę odpowiedzi wywołanych przez FFA). Należy zauważyć, że przy wyższych stężeniach FFA wywołał wzrost fluorescencji z znacznie szybszą kinetyką niż przy niższych stężeniach, mimo że maksymalne poziomy fluorescencji były podobne.
<img src="/files/ftp_upload/3149/3149fig2.jpg" alt="Wykres analizy dawka-odpowiedź, FFA vs Związek A, wpływ stężenia na znormalizowaną odpowiedź." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Zależności stężenie-odpowiedź dla zmiany fluorescencji indukowanej przez FFA oraz hamowania odpowiedzi na FFA indukowanego przez związek A w ludzkich kanałach TRPA1 stabilnie eksprymowanych w komórkach HEK293. Δ, zależność stężenie-odpowiedź dla FFA została wyznaczona poprzez pomiar początkowych szybkości (nachylenia) znormalizowanego wzrostu fluorescencji po dodaniu różnych stężeń FFA. O, zależność stężenie-odpowiedź dla hamowania odpowiedzi wapniowej wywołanej przez FFA przez domniemany antagonista TRPA1, związek A.

<ol><li>Hu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+TRPA1+channels+by+fenamate+nonsteroidal+anti-inflammatory+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Activation of TRPA1 channels by fenamate nonsteroidal anti-inflammatory drugs.</a> Pflugers Arch. 459, 579-592 (2010).</li>
<li>Hu, H., Bandell, M., Petrus, M. J., Zhu, M. X., Patapoutian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+activates+damage-sensing+TRPA1+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Zinc activates damage-sensing TRPA1 ion channels.</a> Nat Chem Biol. 5, 183-190 (2009).</li>
<li>Perney, T. M., Hirning, L. D., Leeman, S. E., Miller, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+calcium+channels+mediate+neurotransmitter+release+from+peripheral+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Multiple calcium channels mediate neurotransmitter release from peripheral neurons.</a> Proc Natl Acad Sci. 83, 6656-6659 (1986).</li>
<li>Mason, S. A., MacLeod, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+action+potential+duration+and+calcium+regulation+in+males+and+females%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Cardiac action potential duration and calcium regulation in males and females.</a> Biochem Biophys Res Commun. 388, 565-570 (2009).</li>
<li>Raat, N. J., Wetzels, G. E., DeMey, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-contraction+relationship+in+rat+mesenteric+arterial+smooth+muscle.+Effects+of+exogenous+and+neurogenic+noradrenaline%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Calcium-contraction relationship in rat mesenteric arterial smooth muscle. Effects of exogenous and neurogenic noradrenaline.</a> Pflugers Arch. 436, 262-269 (1998).</li>
<li>Alagarsamy, S., Johnson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-dependent+calcium+channel+involvement+in+NMDA-induced+activation+of+NOS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Voltage-dependent calcium channel involvement in NMDA-induced activation of NOS.</a> Neuroreport. 6, 2250-2254 (1995).</li>
<li>Su, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPM7+regulates+cell+adhesion+by+controlling+the+calcium-dependent+protease+calpain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">TRPM7 regulates cell adhesion by controlling the calcium-dependent protease calpain.</a> J Biol Chem. 281, 11260-11270 (2006).</li>
<li>Dubinsky, J. M., Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+concentrations+during+%22chemical+hypoxia%22+and+excitotoxic+neuronal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium concentrations during "chemical hypoxia" and excitotoxic neuronal injury.</a> J Neurosci. 11, 2545-2551 (1991).</li>
<li>George, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+channel+activation+augments+NMDA+receptor+function+and+promotes+neurite+outgrowth+in+immature+cerebrocortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sodium channel activation augments NMDA receptor function and promotes neurite outgrowth in immature cerebrocortical neurons.</a> J Neurosci. 29, 3288-3301 (2009).</li>
<li>Price, K. L., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FlexStation+examination+of+5-HT3+receptor+function+using+Ca2%2B+-+and+membrane+potential-sensitive+dyes%3A+advantages+and+potential+problems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">FlexStation examination of 5-HT3 receptor function using Ca2+ - and membrane potential-sensitive dyes: advantages and potential problems.</a> J Neurosci Methods. 149, 172-177 (2005).</li>
<li>Laude, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+functional+assays+of+recombinant+IP3+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Rapid functional assays of recombinant IP3 receptors.</a> Cell Calcium. 38, 45-51 (2005).</li>
<li>Marincsak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+analgesic+drug%2C+tramadol%2C+acts+as+an+agonist+of+the+transient+receptor+potential+vanilloid-1%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">The analgesic drug, tramadol, acts as an agonist of the transient receptor potential vanilloid-1.</a> Anesth Analg. 106, 1890-1896 (2008).</li>
<li>Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+high+throughput+screening+assays+against+three+subtypes+of+Ca%28v%293+T-type+channels+using+molecular+and+pharmacologic+approaches.+Assay+Drug+Dev+Technol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Validation of high throughput screening assays against three subtypes of Ca(v)3 T-type channels using molecular and pharmacologic approaches. Assay Drug Dev Technol.</a> 5, 191-203 (2007).</li>
<li>Christensen, B. N., Kochukov, M., McNearney, T. A., Taglialatela, G., Westlund, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton-sensing+G+protein-coupled+receptor+mobilizes+calcium+in+human+synovial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Proton-sensing G protein-coupled receptor mobilizes calcium in human synovial cells.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 289, C601-C608 (2005).</li>
<li>Boulay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+a+novel+mammalian+homolog+of+Drosophila+transient+receptor+potential+%28Trp%29+involved+in+calcium+entry+secondary+to+activation+of+receptors+coupled+by+the+Gq+class+of+G+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of a novel mammalian homolog of Drosophila transient receptor potential (Trp) involved in calcium entry secondary to activation of receptors coupled by the Gq class of G protein.</a> J Biol Chem. 272, 29672-29680 (1997).</li>
<li>Nanda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+of+adrenergic+receptors+by+measuring+intracellular+calcium+using+the+FlexStation+scanning+fluorimeter%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Functional screening of adrenergic receptors by measuring intracellular calcium using the FlexStation scanning fluorimeter.</a> Biotechnol J. 4, 417-422 (2009).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Wewnątrzkomórkowy Ca2+ odgrywa istotną rolę w wielu stanach fizjologicznych i patologicznych, takich jak uwalnianie neuroprzekaźników (3), potencjał czynnościowy serca (4), skurcz komórek mięśniowych (5), transdukcja sygnałów komórkowych (6-7) oraz ekscytotoksyczna śmierć komórek (8). Pomiar poziomu wewnątrzkomórkowego Ca2+ pomaga wyjaśnić zmiany funkcjonalne kanałów przepuszczalnych dla Ca2+ w błonie komórkowej lub organellach wewnątrzkomórkowych oraz wkład Ca2+ w powyżs...

<table><tbody><tr><td>FlexStation 3</td><td>Molecular Devices</td><td>FLEX3</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet FlexStation, 96-dołkowe</td><td>Molecular Devices</td><td>9000-0912</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655090</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczyste płytki 96-dołkowe z płaskim dnem</td><td>Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>12430-104</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14202</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-ornityna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P36551</td><td></td></tr><tr><td>probenecyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8761</td><td></td></tr><tr><td>Seryjna albumina wołowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr></tbody></table>

komórkowy test wapniowy do przesiewowej analizy funkcji kanałów trp o średniej i wysokiej przepustowości z wykorzystaniem systemu flexstation 3

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

Urządzenie FlexStation 3 firmy Molecular Devices jest stołowym wielomodalnym czytnikiem mikropłytek, umożliwiającym zautomatyzowany pomiar fluorescencji w płytkach wielodołkowych. Jest ono idealne do badań przesiewowych o średniej i wysokiej przepustowości w środowisku akademickim. Posiada zintegrowany moduł transferu cieczy wyposażony w pipetę wielokanałową, a urządzenie odczytuje po jednej kolumnie w celu monitorowania zmian fluorescencji różnych odczynników fluorescencyjnych. Na przykład FlexStation 3 był wykorzystywany do badania funkcji kanałów jonowych przepuszczalnych dla Ca2+ oraz receptorów sprzężonych z białkiem G poprzez pomiar zmian wewnątrzkomórkowych poziomów wolnego Ca2+. Kanały potencjału przejściowego (TRP) to liczna rodzina nieselektywnych kanałów kationowych, które odgrywają istotną rolę w wielu funkcjach fizjologicznych i patofizjologicznych. Większość kanałów TRP jest przepuszczalna dla wapnia i indukuje jego napływ po aktywacji. W tym filmie demonstrujemy zastosowanie FlexStation 3 do badania profilu farmakologicznego kanału TRPA1, który jest molekularnym sensorem licznych bodźców szkodliwych. Komórki HEK293 przejściowo lub stabilnie ekspresujące ludzkie kanały TRPA1, hodowane na płytkach 96-dołkowych, są obciążone czułym na Ca2+ barwnikiem fluorescencyjnym Fluo-4, a zmiany fluorescencji tych komórek w czasie rzeczywistym są mierzone przed i w trakcie aplikacji agonisty TRPA1 przy użyciu trybu FLEX urządzenia FlexStation 3. Zbadano również wpływ domniemanego antagonisty TRPA1. Dane są przenoszone z oprogramowania SoftMax Pro w celu skonstruowania zależności stężenie-odpowiedź dla aktywatorów i inhibitorów TRPA1.

Niniejszy materiał wideo przedstawia szczegółowy protokół badania profilu farmakologicznego ludzkich kanałów TRPA1 przy użyciu systemu FlexStation 3. Protokół obejmuje szczegóły dotyczące przygotowania komórek, ładowania barwnika oraz obsługi czytnika mikropłytek FlexStation 3.

Komórkowy test wapniowy do przesiewowej analizy funkcji kanałów TRP o średniej i wysokiej przepustowości z wykorzystaniem systemu FlexStation 3

FlexStation 3 firmy Molecular Devices to wielofunkcyjny stacjonarny czytnik mikropłytek, umożliwiający zautomatyzowany pomiar fluorescencji w płytkach wielodołkowych. Jest on...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie zastosowania systemu FlexStation 3 do badania profilu farmakologicznego kanału potencjału przejściowego, znanego jako TRPA1. Cel ten zostaje osiągnięty poprzez przygotowanie komórek wykazujących ekspresję kanałów TRPA1 w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych.Po wypłukaniu komórek w myjce do mikropłytek, komórki są obciążane fluorescencyjnym barwnikiem wrażliwym na wapń. Po okresie obciążania komórek następuje kilka dodatkowych etapów płukania. Kolejnym krokiem procedury jest przygotowanie płytki z substancjami, zawierającej agonistę TRPA1 oraz domniemany antagonista TRPA1.W ostatnim kroku parametry oprogramowania są konfigurowane do odczytu płytek w systemie Flex Station three. Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące zależności dawka-odpowiedź dla aktywacji trip A one przez kwas flu fonemicowy oraz inhibicję przez związek antagonistyczny A. Chociaż metoda ta pozwala na poznanie mechanizmów aktywacji 21 poprzez pomiar napływu wapnia, może ona zostać zastosowana również do badania funkcji innych przepuszczalnych dla wapnia kanałów eye oraz białkowych receptorów sprzężonych z białkiem G przy użyciu barwników fluorescencyjnych wrażliwych na wapń lub barwników potencjału błonowego.Główną zaletą tej metody w porównaniu z istniejącymi technikami, takimi jak obrazowanie wapnia i manualne mapowanie patch-clamp, jest fakt, że ta oszczędzająca czas technika umożliwia wysokoprzepustowy screening funkcji i modulacji kanałów wapniowych, żelazowych oraz innych receptorów mobilizujących Ca. Przed rozpoczęciem protokołu należy wyhodować komórki HEK 293 stabilnie transfektowane trip A one do gęstości 70-90%, zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Aby rozpocząć przygotowanie komórek do testu wapniowego, należy pokryć płytki 96-dołkowe, pipetując 50 µL poli-L-ornityny do każdego dołka, a następnie inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez co najmniej 15 minut.Po inkubacji przemyć komórki raz roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym KO. Po trypsynizacji komórek HEC 2 93 przenieść pożądaną ilość komórek do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 mililitrów i odwiruj próbkę. Odpiąć nadsącz i resuspender otrzymany osad komórkowy.W pożywce DMEM uzupełnionej o 10% inaktywowanego serum płodowe cielęce odmierzyć 100 µL zawiesiny komórkowej do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Używając pipety wielokanałowej, pozostawić płytkę w komorze z laminarnym przepływem powietrza na co najmniej 30 minut przed umieszczeniem jej w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowej na 20 do 44 godzin. W celu przygotowania testu wapniowego najpierw sporządzić roztwory zgodnie z opisem w protokole pisemnym.Po przygotowaniu zmieszano 10 µL 1 mM flu oh 4:00 AM z 10 µL onic. F1 27, a następnie całą zawartość przeniesiono do 5 mL buforu do analizy flu. Oh four uzupełnionego o 0,1% albuminy surowicy bydlęcej.Następnie komórki hodowane na płytkach 96-dołkowych przemyć dwa razy roztworem HBSS w ilości 80 µL na dołek, używając myjki do mikropłytek. Po przemyciu, za pomocą pipety wielokanałowej, dodać 50 µL roztworu ładującego Fluo-4 na dołek i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Podczas godzinnego okresu ładowania komórek przygotować serię trzech roztworów agonistów w stężeniu 3x, serię trzech roztworów antagonisty w stężeniu 3x oraz dużą objętość agonisty o stężeniu 300 µM w buforze do analizy Fluo-4.300 µL rozcieńczonych roztworów związków do płytki 96-dołkowej. W miarę możliwości należy zaplanować układ tak, aby rozcieńczenia seryjne związku oraz odpowiadające im kontrole pozytywne i negatywne znajdowały się w tej samej kolumnie płytki. Ponieważ stacja Flex trzy odczytuje jedną kolumnę na raz, w ostatnim etapie przygotowania komórek należy pipetować 300 µL roztworu agonisty o stężeniu 300 µM do dołka sąsiadującego z każdym dołkiem zawierającym antagonistę.Przemyj załadowane komórki trzykrotnie buforem kwasowym fluo-4 za pomocą myjki do mikropłytek, pozostawiając bufor po ostatnim przemyciu. W każdej studzience powinno pozostać 80 µL buforu kwasowego fluo-4. Aby rozpocząć odczyt płytki, włącz system Flex Station 3 i uruchom oprogramowanie SoftMax Pro 5.2.Zapisz eksperyment pod nową nazwą pliku w ustawieniach. Wybierz tryb flex i wprowadź parametry pomiaru efektu agonisty i antagonisty, zgodnie z listą w procedurze pisemnej. Następnie umieść nowe pudełko z końcówkami, płytkę związków oraz płytkę do odczytu w odpowiednich tackach stacji flex.Trzy.Rozpocznij odczyt płytki, klikając przycisk read w oprogramowaniu Soft Max Pro. Urządzenie Flex Station three będzie odczytywać po jednej kolumnie na raz i dodawać związki w zaprogramowanych punktach czasowych bez przerywania procesu odczytu. Po zakończeniu pomiaru dane eksperymentalne można przetwarzać bezpośrednio w oprogramowaniu Soft Max PRO lub skopiować i wkleić do dowolnego programu arkusza kalkulacyjnego, takiego jak Microsoft Excel.Aby przeanalizować dane, należy wygenerować krzywe zależności odpowiedzi od stężenia dla agonisty TRPA1 kwasu flupnemonowego oraz dla domniemanego związku antagonisty TRPA1, stosując metodę dopasowania najmniejszych kwadratów, zgodnie z opisem w procedurze pisemnej. TRPA1 jest kanałem kationowym przepuszczalnym dla wapnia, którego aktywacja prowadzi do napływu wapnia, który można wykryć za pomocą barwnika wrażliwego na wapń Fluo-4 AM. Reprezentatywne zapisy przebiegów czasowych zmian fluorescencji w odpowiedzi na szereg stężeń kwasu flupnemonowego (FFA) przedstawiono przy wyższych stężeniach. W przypadku wyższych stężeń FFA wzrost fluorescencji wywołany przez FFA charakteryzuje się znacznie szybszą kinetyką niż przy niższych stężeniach, pomimo podobnych poziomów fluorescencji szczytowej.Aby wyróżnić te różnice, zależności stężeniowo-odpowiedzi zbudowano poprzez pomiar początkowych szybkości wzrostu fluorescencji. Po dodaniu różnych stężeń FFA ustalono, że połowa maksymalnego stężenia efektywnego FFA wynosi 55,4 micromolar. Przedstawiono również zależność stężeniowo-odpowiedzi hamowania wywołanej przez FFA odpowiedzi wapniowej przez domniemany antagonista TRPA1, związek A.Dawka niezależnie zredukowała odpowiedź komórek trip A one na FFA z połowową maksymalną stężeniem hamującym wynoszącym 4,3 micromolar. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak badać profile farmakologiczne kanałów triple A one i pokrewnych przy użyciu stacji flag station three.

cell-based-calcium-assay-for-medium-to-high-throughput-screening-trp

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Test wapnia oparty na komórkach do średniego i wysokiego przepływu przesiewowego funkcji kanałów TRP z wykorzystaniem FlexStation 3

Przedstawiono metody opracowania i walidacji ilościowego testu fluorescencyjnego do pomiaru aktywności kanałów potasowych prostujących do wewnątrz (Kir) w celu wysokoprzepustowego przesiewu związków.

Wysokoprzepustowe badanie przesiewowe w celu poszukiwania małocząsteczkowych modulatorów potasowych kanałów prostujących do wewnątrz

Opisany tutaj test mobilizacji wapnia oparty na fluorescencji jest średnioprzepustowym systemem badań przesiewowych farmakologii odwrotnej do identyfikacji funkcjonalnie aktywujących ligandów sierocych receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR).

Charakterystyka receptorów sprzężonych z białkiem G za pomocą testu mobilizacji wapnia opartego na fluorescencji

Tutaj prezentujemy techniki obrazowania lokalnych zdarzeń Ca2+ za pośrednictwem IP3 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w nienaruszonych komórkach ssaków załadowanych wskaźnikami Ca2+ wraz z algorytmem, który automatyzuje identyfikację i analizę tych zdarzeń.

Obrazowanie lokalnych sygnałów Ca2+ w hodowanych komórkach ssaków

Prezentujemy protokoły zastosowania naszego ukierunkowanego, genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia (GECI) CatchER+ do monitorowania szybkich stanów przejściowych wapnia w retikulum endoplazmatycznym/sarkoplazmatycznym (ER/SR) HEK293 i komórkach C2C12 mięśni szkieletowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w czasie rzeczywistym. Omówiono również protokół pomiaru i kalibracji in situ Kd.

Monitorowanie uwalniania wapnia ER/SR za pomocą ukierunkowanego czujnika Ca2+ CatchER+

Opisany test komórkowy jest przeznaczony do identyfikacji czynników oddziałujących z receptorem chemokiny 4 (CXCR4) CXC, które hamują lub stymulują, konkurencyjnie lub allosterycznie, wewnątrzkomórkowe uwalnianie Ca2+ zainicjowane przez aktywację CXCR4.

Test mobilizacji Ca2 + oparty na fluorescencji kinetycznej w celu identyfikacji agonistów, antagonistów i modulatorów allosterycznych sprzężonych z białkiem G

Opisano techniki generowania biblioteki krótkich peptydów, które mogą aktywować komórki tuczne za pośrednictwem receptora MRGPRX2. Powiązane techniki są łatwe, niedrogie i można je rozszerzyć na inne receptory komórkowe.

Peptydy przesiewowe, które aktywują MRGPRX2 za pomocą zmodyfikowanych komórek HEK

Obecny protokół opisuje całkowicie optyczną kontrolę i obserwację wyzwalanej aktywności komórkowej w kardiomiocytach pochodzących z iPSC (iPSC-CMs) dla wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków i testów toksyczności. Pokazano wieloparametryczną kwantyfikację wzorców fenotypowych w czasie i przestrzeni. Wykazano długoterminowe działanie leków w ciągu godzin lub sekwencyjne pomiary w ciągu kilku dni.

Wysokoprzepustowe sterowanie optyczne i rejestrowanie sygnału wapnia w kardiomiocytach pochodzących z iPSC do badań toksyczności i fenotypowych badań przesiewowych leków

Ten protokół opisuje metodę badania elektrogenicznych białek błonowych poprzez pomiar zmian potencjału błonowego. Test ten stanowi platformę do funkcjonalnego odczytu wielu kanałów jonowych ulegających endogenicznej ekspresji w liniach komórkowych nabłonka.

Oparty na fluorescencji test potencjału błonowego do wysokoprzepustowego badania funkcjonalnego dwóch endogennych kanałów jonowych w dwóch nabłonkowych liniach komórkowych

W tej pracy opisano wysokoprzepustowy, wewnątrzkomórkowy test fluorescencji wapnia dla 384-dołkowych płytek do badania bibliotek małych cząsteczek na rekombinowanych receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR). Cel, receptor kininowy kleszcza pomoru bydła, Rhipicephalus microplus, ulega ekspresji w komórkach CHO-K1. Ten test identyfikuje agonistów i antagonistów przy użyciu tych samych komórek w jednym teście "podwójnej addycji".

Test fluorescencji wapnia z "podwójnym dodaniem" do wysokoprzepustowych badań przesiewowych rekombinowanych receptorów sprzężonych z białkiem G

Farmakologiczne celowanie w kanały jonowe jest obiecującym podejściem do leczenia guzów litych. Podano szczegółowe protokoły charakteryzujące funkcję kanałów jonowych w komórkach nowotworowych i oznaczające wpływ modulatorów kanałów jonowych na żywotność raka.

Badania przesiewowe kanałów jonowych w komórkach nowotworowych

Ten artykuł przedstawia metodę ilościowego monitorowania stężenia jonów wapnia (Ca2+) w komórkach w czasie rzeczywistym za pomocą jednokomórkowego obrazowania Ca2+ barwnikiem Fura-2/AM. Technika ta umożliwia efektywne ładowanie barwnika i dokładne obliczanie poziomów Ca2+ za pomocą współczynników intensywności fluorescencji, dzięki czemu jest to proste i szybkie podejście do zastosowań badawczych.

Obrazowanie wapnia w pojedynczych komórkach do badania aktywacji kanałów jonowych wapnia

Poznaj komórkowy test wapniowy do badania profilu farmakologicznego kanałów TRPA1 przy użyciu FlexStation 3. Ta metoda umożliwia szybkie przesiewowe badanie modulacji kanałów w warunkach wysokoprzepustowych.

Komórkowy test wapniowy do przesiewowej analizy funkcji kanałów TRP o średniej i wysokiej przepustowości z wykorzystaniem systemu FlexStation 3

Przeglądaj więcej filmów