Obrazowanie w wysokiej rozdzielczości receptorów neuroprzekaźników w synapsach siatkówki

Weź przekrój siatkówki myszy na siatce mikroskopu elektronowego. Sekcja zawiera komórki zwojowe siatkówki lub RGC, synaptycznie połączone z komórkami dwubiegunowymi.

Presynaptyczne komórki dwubiegunowe zawierają pęcherzyki neuroprzekaźników ułożone w strukturę wstęgową w pobliżu błony synaptycznej.

Postsynaptyczne RGC mają skupione receptory neuroprzekaźników na swojej błonie. Komórki te są znakowane podjednostką B lub CTB toksyny.

Przemyć buforem w celu utrzymania pH.

Inkubuj z buforem blokującym, aby zamaskować niespecyficzne miejsca wiązania.

Inkubować z pierwszorzędowymi przeciwciałami skierowanymi przeciwko receptorom neuroprzekaźników i CTB.

Przemyć buforem w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał i utrzymania pH.

Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z nanocząstkami złota o różnych rozmiarach, które wiążą się z przeciwciałami pierwszorzędowymi, znakując cząsteczki docelowe.

Usuń niezwiązane przeciwciała, a następnie wysusz próbkę na powietrzu.

Zastosuj metale ciężkie, które wiążą makrocząsteczki, zwiększając kontrast.

Za pomocą mikroskopii elektronowej zidentyfikuj RGC za pomocą znakowanych CTB i zlokalizuj znakowane receptory neuroprzekaźników.

Na tym etapie należy wyciąć ultracienkie odcinki o grubości 70 nanometrów za pomocą ultramikrotomu i zebrać je na siatkach niklowych pokrytych węglem Formvar. Umyj kratki raz w wodzie destylowanej, a następnie trzy razy przepłucz TBS. Następnie inkubować siatki w 20 mikrolitrach 5% BSA w TBS przez 30 minut, a następnie w 20 mikrolitrach mieszaniny zawierającej kozi anty-CTB i przeciwciało przeciwko jednej podjednostce NMDAR przez noc w temperaturze pokojowej.

Następnie umyj kratki trzy razy 20 mikrolitrami TBS za każdym razem przy pH 7,6. Następnie umyj kratki raz TBS o pH 8,2 przez pięć minut. Inkubować siatki przez dwie godziny z 20 mikrolitrami mieszaniny zawierającej anty-króliczą IgG osła, sprzężoną z 10-nanometrowymi cząstkami złota i anty-kozią IgG osła sprzężoną z 18 nanometrowymi cząstkami złota.

Po dwóch godzinach umyj kratki w 20 mikrolitrach TBS o pH 7,6 trzy razy, a następnie umyj je w ultraczystej wodzie. A następnie wysuszyć kratki na powietrzu. Następnie przeciwbarwić siatki 5% octanem uranylu w wodzie destylowanej przez osiem minut, a następnie 0,3% cytrynianem ołowiu w wodzie destylowanej przez pięć minut w ciemności.