JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 2:52 min. • April 28th, 2025
Zacznij od wielodołkowej płytki zawierającej przylegające rekombinowane komórki ssaków w roztworze stymulacyjnym uzupełnionym lucyferyną, podłożem luminescencyjnym.
Inkubuj, aby umożliwić lucyferynie wejście do komórki.
Komórki te wyrażają receptory zapachowe związane z błoną w połączeniu z białkami węchowymi G i białkami transportującymi receptory.
Dodatkowo, komórki wyrażają cytoplazmatyczne białka Glosensor, białka luminescencyjne wrażliwe na cykliczne AMP.
Rozpocznij pomiar luminescencji.
Cząsteczki odorantu wiążą się z receptorami zapachowymi komórek, aktywując sprzężone białko G i dysocjując podjednostkę α białka G, czyli Gα.
Zdysocjowana podjednostka Gα wiąże się z enzymem cyklazy adenylanowej osadzonym w błonie, aktywując go. Aktywowany enzym przekształca ATP w cykliczne AMP.
Te cykliczne AMP wiążą się z białkami glosensor, zmieniając ich konformację i umożliwiając wiązanie lucyferyny.
Ta interakcja wytwarza luminescencję, potwierdzając aktywację receptorów zapachowych.
Dodaj 75 mikrolitrów roztworu odczynnika cAMP. Usuń roztwór stymulujący ze studzienek i dodaj 25 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu odczynnika cAMP do każdej studzienki. Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze pokojowej w ciemnym i wolnym od zapachu środowisku przez dwie godziny.
Najpierw rozcieńczyć acetofenon nazapachowy do 1% w 10 mililitrach oleju mineralnego i zakryć rurkę. Przed końcem czasu inkubacji odczynnika cAMP dodaj 25 mikrolitrów roztworu nawaniacza do każdej studzienki na nowej 96-dołkowej płytce. Następnie umieść tę płytkę nawaniającą w komorze luminometru na pięć minut, aby zrównoważyć komorę z lotnymi cząsteczkami nawaniania. Ustaw luminometr tak, aby rejestrował luminescencję z zerowym sekundowym opóźnieniem podczas 20 cykli 90-sekundowego pomiaru na płytce, z 0.7 sekundy przerwy między cyklami.
Tuż przed odczytaniem tabliczki wyjmij płytkę nawaniającą z komory. Do płytki 96-dołkowej zawierającej transfekowane komórki dodaj 25 mikrolitrów środka zapachowego w przestrzeni między studzienkami i szybko włóż płytkę z powrotem do komory. Rozpocznij pomiar luminescencji wszystkich studzienek przez 20 cykli w ciągu 30 minut.