JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:01 min. • April 28th, 2025
Weźmy znieczulony szczur kontrolny i model szczura z laserowo wywołanym uszkodzeniem mózgu.
Aplikacja lasera na prawą półkulę uszkodziła komórki i barierę krew-mózg, czyli BBB, która oddziela krew od tkanki mózgowej.
Wstrzyknąć barwnik śledzący do kaniulowanej żyły ogonowej, która przechodzi przez krążenie ogólnoustrojowe, aby dotrzeć do mózgu.
Barwnik wiąże się z białkami osocza i przenika do tkanki mózgowej przez uszkodzoną barierę krew-mózg.
Uśmiercić szczury.
Przeprowadzić fuzję szczurów przez serce, aby usunąć barwnik z krążenia.
Wyodrębnij i pokrój mózg, wyizoluj wycinki z uszkodzonej półkuli i zhomogenizuj je.
Traktuj kwaśnym roztworem, aby zdenaturować białka, uwalniając barwnik związany z białkiem.
Odwirować i wyizolować supernatant zawierający barwnik. Dodaj alkohol, aby zwiększyć fluorescencję barwnika.
Przenieś roztwór na mikropłytkę. Po wzbudzeniu wyższa intensywność fluorescencji w uszkodzonym mózgu wskazuje na uszkodzenie BBB wywołane laserem.
Aby ocenić częstość uszkodzenia bariery krew-mózg, 24 godziny po urazie wywołanym laserem należy załadować strzykawkę 2% niebieskim barwnikiem Evansa, rozcieńczonym w 4 mililitrach na kilogram roztworu soli fizjologicznej i dostarczyć roztwór dożylnie rannym i kontrolnym szczurom przez kaniulowaną żyłę ogonową.
Pozwól roztworowi krążyć przez godzinę, zanim użyjesz zestawów szpilek chirurgicznych i nożyczek, aby otworzyć klatkę piersiową pierwszego zwierzęcia. Wykonaj perfuzję odsłoniętego serca schłodzoną 0,9% solą fizjologiczną przez lewą komorę pod ciśnieniem 110 milimetrów słupa rtęci, aż z prawego przedsionka zaobserwuje się bezbarwną ciecz perfuzyjną.
Następnie zbierz mózg i uzyskaj 2-milimetrowe plasterki rostrocaudalne. Oddziel lewe wycinki mózgu od prawych wycinków mózgu, aby umożliwić ocenę uszkodzonych i nieuszkodzonych półkul oddzielnie, a następnie zważyć próbki. Homogenizować próbki za pomocą moździerza i tłuczka, a następnie inkubować próbki tkanek w 50% kwasie trichlorooctowym przez 24 godziny.
Następnego dnia odwirowywano homogenizowane próbki tkanki mózgowej przez 20 minut w temperaturze 10 000 razy i w temperaturze pokojowej. Wymieszaj 1 mililitr supernatantu z 1,5 mililitra 96% etanolu w stosunku 1 do 3. Następnie użyj detektora fluorescencji o wzbudzeniu 620 nanometrów i długości fali emisji 680 nanometrów, aby ocenić przerwanie bariery krew-mózg.