JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 4:15 min • April 28th, 2025
Weźmy szkiełko z komorą zawierające jednowarstwową hodowlę mikronaczyniowych komórek śródbłonka mózgu szczura lub RBMEC, naśladując warstwę komórek śródbłonka bariery krew-mózg.
Komórki wykazują zakłócone białka połączeń ścisłych i włókna stresu aktynowego z powodu stresu spowodowanego niedoborem tlenu i glukozy, po którym następuje reoksygenacja.
Usuń pożywkę i umyj komórki, nałóż utrwalacz, aby zachować architekturę komórki, a następnie zmyj nadmiar utrwalacza
.Skorzystaj z detergentu, aby udrożnić błony komórkowe.
Inkubuj za pomocą środka blokującego, aby zamaskować niespecyficzne miejsca wiązania.
Aby oznaczyć białka o ścisłym połączeniu, inkubuj z określonymi przeciwciałami pierwotnymi, a następnie usuń przeciwciała niezwiązane.
Inkubuj z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem, aby oznaczyć przeciwciała pierwszorzędowe.
Alternatywnie, aby oznaczyć włókna stresu, dodaj falloidynę znakowaną fluoroforem.
Umyj, aby usunąć niezwiązane cząsteczki etykietujące.
Wyjmij komorę, nałóż podłoże montażowe zawierające fluorescencyjny barwnik wiążący DNA do barwienia jąder, a następnie uszczelnij szkiełkiem nakrywkowym.
Za pomocą mikroskopii konfokalnej wizualizuj fluorescencyjnie znakowane białka ścisłego połączenia i włókna stresowe.
Rozpocznij od wystawienia każdej studzienki monowarstw RBMEC na 100 do 200 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy Opti-MEM i kontynuuj ich inkubację przez godzinę. Następnie umyj szkiełka komory trzy razy, używając od 100 do 200 mikrolitrów PBS na studzienkę na mycie. Utrwal komórki 4% paraformaldehydem w PBS i inkubuj szkiełka przez 15 minut w temperaturze pokojowej. I zmyj komórki trzy razy PBS, tak jak poprzednio.
Teraz przeniknij komórki, nakładając od 100 do 200 mikrolitrów 0,5% Triton X-100 w PBS do każdej studzienki. I pozwól płytce inkubować przez kolejne 15 minut w temperaturze pokojowej. Po przeniknięciu komórek nałóż roztwór blokujący. I pozwól temu działać na komórki przez godzinę w temperaturze pokojowej.
Następnie wykonaj immunofluorescencję białka ZO-1 lub znakuj F-aktynę. Aby przeprowadzić immunofluorescencję komórek dla ZO-1, inkubuj je z przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnego dnia umyj komórki trzy razy w PBS, na przykład podczas usuwania utrwalacza. Następnie inkubować komórki w 100 do 200 mikrolitrach wtórnego przeciwciała przeciw królikowi FITC przez godzinę w temperaturze pokojowej, aby oznaczyć komórki falloidyną rodaminy.
Po zastosowaniu roztworu blokującego przez godzinę należy wystawić komórki na działanie 100 do 200 mikrolitrów falloidyny rodaminy w rozcieńczeniu od 1 do 50, z 2% BSA PBS przez 20 minut. Po inkubacji przeciwciała drugorzędowego lub falloidyny rodaminy należy ponownie trzykrotnie przemyć komórki PBS, tak jak poprzednio. Następnie wyjmij komory, odklejając gumkę. Przystąp do montażu szkiełek przy użyciu medium zawierającego antifade i DAPI. Zobrazuj komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej w jednej płaszczyźnie za pomocą obiektywu 60x.