JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 4:15 min. • April 28th, 2025
Weźmy szkiełko z komorą zawierające jednowarstwową hodowlę mikronaczyniowych komórek śródbłonka mózgu szczura lub RBMEC, naśladując warstwę komórek śródbłonka bariery krew-mózg.
Komórki wykazują zakłócone białka połączeń ścisłych i włókna stresu aktynowego z powodu stresu spowodowanego niedoborem tlenu i glukozy, po którym następuje reoksygenacja.
Usuń pożywkę i umyj komórki, nałóż utrwalacz, aby zachować architekturę komórki, a następnie zmyj nadmiar utrwalacza
.Skorzystaj z detergentu, aby udrożnić błony komórkowe.
Inkubuj za pomocą środka blokującego, aby zamaskować niespecyficzne miejsca wiązania.
Aby oznaczyć białka o ścisłym połączeniu, inkubuj z określonymi przeciwciałami pierwotnymi, a następnie usuń przeciwciała niezwiązane.
Inkubuj z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem, aby oznaczyć przeciwciała pierwszorzędowe.
Alternatywnie, aby oznaczyć włókna stresu, dodaj falloidynę znakowaną fluoroforem.
Umyj, aby usunąć niezwiązane cząsteczki etykietujące.
Wyjmij komorę, nałóż podłoże montażowe zawierające fluorescencyjny barwnik wiążący DNA do barwienia jąder, a następnie uszczelnij szkiełkiem nakrywkowym.
Za pomocą mikroskopii konfokalnej wizualizuj fluorescencyjnie z
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych