Przeprowadzanie immunohistochemii na tkance mózgowej naczelnych innych niż człowiek

Zacznij od chemicznie utrwalonego wycinka mózgu naczelnych innych niż człowiek.

Utrwalacz na bazie aldehydu sieciuje białka, zachowując strukturę tkanki, ale pozostawia pewne reaktywne reszty aldehydu.

Umyć, aby usunąć warstwę krioprotektantu otaczającą część tkanki.

Dodaj środek redukujący, aby zneutralizować reaktywne grupy aldehydowe, wytwarzając produkty uboczne reakcji.

Umyć, aby usunąć te produkty uboczne i nadmiar środków redukujących.

Zastosuj roztwór blokujący, aby zapobiec wiązaniu się nieswoistych przeciwciał.

Dodaj pierwszorzędowe przeciwciała skierowane przeciwko białku ulegającemu ekspresji w określonych miejscach błony neuronalnej.

Przemyć, aby usunąć niezwiązane przeciwciała.

Dodaj biotynylowane przeciwciała drugorzędowe skierowane przeciwko przeciwciałom pierwszorzędowym.

Przemyć, aby usunąć niezwiązane przeciwciała.

Nałożyć kompleksy awidyna-biotyna-peroksydaza, które wiążą się z przeciwciałami drugorzędowymi.

Umyj ponownie, aby usunąć niezwiązane kompleksy.

Wprowadzić podłoże chromogenne wraz z nadtlenkiem wodoru. W obecności nadtlenku wodoru enzym peroksydaza utlenia substrat, tworząc brązowe osady.

Rozpocznij od przeniesienia 50-mikronowych odcinków mózgu naczelnych utrwalonych w akroleinie, zawierających obszar zainteresowania, na 12-dołkową płytkę zawierającą PBS. Umyć swobodnie pływające sekcje trzy razy w PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie inkubować skrawki w świeżo przygotowanym roztworze borowodorku sodu przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Kołysz się delikatnie bez pokrowca.

Po upływie 30 minut odessać borowodorek sodu i dodać PBS do każdej studzienki. Umieść talerz na bujaczku i energicznie potrząsaj przez 10 minut. Powtórz pranie jeszcze dwa razy lub do momentu, gdy nie pozostanie żaden gaz reakcyjny. Zablokuj skrawki przez inkubację w roztworze 2% normalnej surowicy i 0,5% zimnej żelatyny rybnej, rozcieńczonej w PBS przez godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem.

Po upływie czasu inkubacji należy inkubować skrawki i roztwór przeciwciała pierwotnego, delikatnie kołysząc przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego dnia, po umyciu skrawków jak poprzednio, inkubować skrawki w roztworze przeciwciał wtórnych przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem. Po umyciu skrawków jak poprzednio, inkubować w peroksydazie awidyny-biotyny lub roztworze ABC przez godzinę z kołysaniem.

Następnie przygotuj świeży roztwór 0,05% 3,3-diaminobenzydyny z 0,005% nadtlenkiem wodoru rozcieńczonym w TBS. Po umyciu inkubować skrawki w roztworze DAB przez trzy do siedmiu minut, delikatnie kołysząc. Gdy brązowy osad osiągnie pożądany kolor, zatrzymaj reakcję, szybko myjąc dwukrotnie w zimnym TBS, a następnie przez serię czasowych płukań TBS i PB.