JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:36 min. • April 28th, 2025
Zrób slajd z zatopionymi w parafinie sekcjami neurosfer guza mózgu, skupiskami nerwowych komórek macierzystych wykazujących specyficzne dla nowotworu biomarkery białka jądrowego.
Podgrzej, aby stopić parafinę, usuń ją za pomocą ksylenu i ponownie nawodnij tkankę za pomocą zmniejszających się stężeń alkoholu.
Podgrzej w kwaśnym buforze zawierającym detergent, aby zdemaskować epitopy na biomarkerach i przeniknąć przez błony komórkowe.
Spłucz, a następnie potraktuj środkiem utleniającym, aby dezaktywować endogenne enzymy peroksydazy, zapobiegając niespecyficznym sygnałom.
Zastosuj rozwiązanie blokujące, aby zamaskować niespecyficzne miejsca wiązania.
Inkubuj z pierwszorzędowymi przeciwciałami skierowanymi na epitopy biomarkerów.
Spłucz, a następnie potraktuj przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z biotyną, które wiążą się z przeciwciałami pierwszorzędowymi.
Spłucz i inkubuj z awidyną sprzężoną z peroksydazą, która wiąże się z biotyną.
Dodaj substrat chromogeniczny i środek utleniający.
Peroksydaza wykorzystuje czynnik do przekształcania substratu w kolorowe osady, oznaczając lokalizację biomarkera.
Przeciwbarwić jądra, odwodnić tkankę w alkoholu i zamontować szkiełko do obrazowania rozkładu biomarkerów.
Najpierw rozpuść parafinę, inkubując szkiełka w metalowym stojaku w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 20 minut. Następnie odparafinowano szkiełka poprzez inkubację w pociągu do nawadniania w temperaturze pokojowej zgodnie z protokołem Tex. Szkiełka należy przechowywać w wodzie z kranu, aby zapobiec wiązaniu się przeciwciał nieswoistych. Następnie inkubować szkiełka w buforze cytrynianowym w temperaturze 125 stopni Celsjusza przez 30 sekund w temperaturze 90 stopni Celsjusza przez 10 sekund. Poczekaj, aż szkiełka ostygną, a następnie spłucz je pięciokrotnie wodą destylowaną.
Następnie inkubuj szkiełka w temperaturze pokojowej w 0,3% nadtlenku wodoru przez 20 minut. Następnie myć szkiełka przez pięć minut trzykrotnie w buforze do mycia, delikatnie mieszając. Inkubować szkiełka przez noc w wilgotnej komorze ustawionej na 4 stopnie Celsjusza z rozcieńczonym przeciwciałem pierwszorzędowym. Następnie umyj szkiełka trzy razy przez pięć minut, delikatnie mieszając.
Następnie inkubować szkiełka w rozcieńczonym biotynylowanym przeciwciałie drugorzędowym w temperaturze pokojowej przez godzinę. Myć szkiełka trzy razy przez pięć minut w buforze myjącym, delikatnie mieszając. Następnie inkubuj szkiełka w biotynylowanym kompleksie peroksydazy chrzanowej awidyny w temperaturze pokojowej w ciemności przez godzinę przez godzinę. Powtórz pranie zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie inkubować szkiełka z pasmami substratu nadtlenku wodoru przez dwie do pięciu minut w temperaturze pokojowej.
Opłucz szkiełka wodą z kranu i zanurz je w roztworze hematoksyliny, aby je zanieczyścić. Następnie dokładnie opłucz szkiełka w wodzie z kranu, aż woda będzie czysta. Odwodnić szkiełka zgodnie z protokołem Tex. Na koniec nakryj szkiełka za pomocą medium montażowego na bazie ksylenu i pozostaw je do wyschnięcia na płaskiej powierzchni w temperaturze pokojowej.