JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 2:08 min • April 28th, 2025
Zacznij od próbki tkanki mózgowej, która jest nieprzezroczysta ze względu na obecność pigmentów i lipidów. Składniki te powodują rozpraszanie światła w neuronach znakowanych fluorescencyjnie.
Sekwencyjnie inkubuj tkankę w roztworach o rosnącym stężeniu metanolu, aby usunąć z niej wodę i stopniowo odwadniać tkankę.
Następnie potraktuj tę tkankę skoncentrowanym metanolem, aby wyeliminować resztki wody, zapewniając całkowite odwodnienie.
Następnie przenieś tkankę do początkowego rozpuszczalnika czyszczącego zawierającego dichlorometan i metanol.
Inkubować z delikatnym potrząsaniem, aby rozpuszczalnik mógł głęboko wniknąć w tkankę.
Dichlorometan usuwa pigmenty i lipidy z tkanki, zmniejszając rozpraszanie światła i zwiększając przezroczystość.
Na koniec, przenieś tkankę do eteru dibenzylowego, rozpuszczalnika hydrofobowego i inkubuj bez wstrząsania.
Rozpuszczalnik działa jako końcowy środek czyszczący, który dodatkowo zwiększa przezroczystość tkanki.
Ten proces poprawia przenikanie światła, umożliwiając wyraźniejszą wizualizację oznaczonych neuronów i ich połączeń w tkance mózgowej próbka.
Próbkę inkubować seryjnie w 20%, 40%, 60%, 80% i 100% metanolu przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie inkubuj go w świeżym 100% metanolu przez noc. Następnego dnia inkubować próbkę w świeżo przygotowanym 66% DCM w 33% metanolu przez trzy godziny w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem. Po trzech godzinach inkubować próbkę w eterze dibenzylowym, nie wstrząsając, aż stanie się klarowna. Następnie przechowuj go w eterze dibenzylowym do czasu obrazowania.