Obrazowanie transportu białka GLUT4 w pierwotnych neuronach podwzgórza myszy za pomocą mikroskopii dekonwolucyjnej

Zacznij od pierwotnych neuronów podwzgórza myszy typu dzikiego i CCR5 z nokautem, hodowanych na szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-D-lizyną na płytce wielodołkowej.

Te neurony wyrażają transporter-4 glukozy znakowany zielonym fluorescencyjnym białkiem (GFP-GLUT4) w cytoplazmie.

Przenieś szkiełka nakrywkowe na szkiełka podstawowe i delikatnie zetrzyj nadmiar nośnika, aby zapewnić stabilność podczas pozyskiwania obrazu.

Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu dekonwolucyjnego z szkiełkiem nakrywkowym skierowanym w dół.

Wizualizuj neurony w świetle jasnego pola, a następnie potraktuj je kolejno chemokiną CCL5 i insuliną.

Przełącz się na oświetlenie fluorescencyjne, aby zidentyfikować neurony docelowe z ekspresją GFP-GLUT4 i dostosować parametry obrazowania, aby uchwycić obrazy fluorescencyjne na żywo.

W neuronach typu dzikiego, insulina i CCL5 wiążą się odpowiednio z receptorem insuliny i CCR5, aktywując dalsze szlaki sygnałowe, które napędzają translokację błony GFP-GLUT4.

W neuronach z nokautem CCR5 CCL5 nie wiąże się, co skutkuje zmniejszoną translokacją GFP-GLUT4.

Uchwyć obrazy i zastosuj algorytm dekonwolucji, aby zredukować nieostre światło, zwiększając klarowność i rozdzielczość obrazu.

Aby przygotować komórki do obrazowania na żywo, ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe z neuronami za pomocą kleszczy i ostrożnie umieść je na szkiełku podstawowym. Następnie usuń nadmiar podłoża za pomocą delikatnych chusteczek zadaniowych, składając je dwukrotnie i ostrożnie umieszczając na szkiełku nakrywkowym, nie przesuwając go.

Konieczne jest usunięcie nadmiaru podłoża, aby zapobiec niepotrzebnemu przesuwaniu się szkiełka nakrywkowego.

Następnie potraktuj wybrane próbki komórek CCL5 w dawce 10 nanogramów na mililitr lub insuliną w dawce 10 jednostek na mililitr przez jedną minutę. Następnie dodaj 1,5 mikrolitra rozcieńczonej insuliny na krawędź szkiełek nakrywkowych. Następnie dodaj olejek immersyjny na soczewkę obiektywu 1,52 NA o powiększeniu 60 razy.

Następnie umieść szkiełka nakrywkowe na stoliku mikroskopu dekonwolucyjnego tak, aby szkiełka nakrywkowe były skierowane w dół i odpowiednio zabezpieczone. Użyj jasnego pola lub oświetlenia fluorescencyjnego, aby zidentyfikować komórki docelowe. Następnie dostosuj ostrość, aż komórki docelowe będą wyraźnie widoczne. Nie przesuwaj soczewki obiektywu poza obszar szkiełka nakrywkowego, aby uniknąć niepotrzebnych zadrapań.

Następnie zidentyfikuj GFP-GLUT4 na podstawie sygnału GFP. Następnie zidentyfikuj żądane komórki docelowe do akwizycji obrazu. Następnie ustaw odpowiednie parametry eksperymentalne dla każdej komórki docelowej, w tym liczbę pikseli, długość fali wzbudzenia, procent transmisji, czas ekspozycji, grubość stosu, przedział czasu i całkowity czas obrazowania. Dostosuj parametr ekspozycji do około 2 000 do 3 000 zliczeń, aby uzyskać maksymalną intensywność pikseli.

Aby zminimalizować fotowybielanie fluorescencyjne, należy maksymalnie zmniejszyć procent przepuszczalności światła wzbudzającego, utrzymując czas ekspozycji krótszy niż 1 sekunda. Ustaw górną i dolną granicę stosu z na każdej komórce docelowej, przesuwając stolik mikroskopu, aż górna i dolna część komórki docelowej będą nieco nieostre.