JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:38 min. • April 28th, 2025
Zacznij od pierwotnych neuronów podwzgórza myszy typu dzikiego i CCR5 z nokautem, hodowanych na szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-D-lizyną na płytce wielodołkowej.
Te neurony wyrażają transporter-4 glukozy znakowany zielonym fluorescencyjnym białkiem (GFP-GLUT4) w cytoplazmie.
Przenieś szkiełka nakrywkowe na szkiełka podstawowe i delikatnie zetrzyj nadmiar nośnika, aby zapewnić stabilność podczas pozyskiwania obrazu.
Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu dekonwolucyjnego z szkiełkiem nakrywkowym skierowanym w dół.
Wizualizuj neurony w świetle jasnego pola, a następnie potraktuj je kolejno chemokiną CCL5 i insuliną.
Przełącz się na oświetlenie fluorescencyjne, aby zidentyfikować neurony docelowe z ekspresją GFP-GLUT4 i dostosować parametry obrazowania, aby uchwycić obrazy fluorescencyjne na żywo.
W neuronach typu dzikiego, insulina i CCL5 wiążą się odpowiednio z receptorem insuliny i CCR5, aktywując dalsze szlaki sygnałowe, które napędzają translokację błony GFP-GLUT4.
W neuronach z nokautem CCR5 CCL5 nie wiąże się, co skutkuje zmniejszoną translokacją GFP-GLUT4.
Uchwyć obrazy i zastosuj algorytm dekonwolucji, aby zredukować nieostre światło, zwiększając klarowność i rozdzielczość obr
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych