Obrazowanie aktywacji neuronów hipokampa w sekcjach mózgu myszy

Zacznij od sekcji mózgu myszy odsłaniających grzbietowy hipokamp, bogaty w neurony.

Dodaj nadtlenek wodoru, aby stłumić aktywność peroksydazy neuronalnej, a następnie umyj.

Traktuj buforem przepuszczalności, a następnie zastosuj bufor blokujący, aby zablokować niespecyficzne wiązanie.

Dodaj przeciwciała pierwszorzędowe i inkubuj z mieszaniem. Przeciwciała te wiążą się z białkami markerowymi aktywacji neuronów.

Umyj i nałóż przeciwciała drugorzędowe sprzężone z biotyną, aby związać przeciwciała pierwszorzędowe.

Spłucz i wprowadź kompleks awidyna-biotyna-peroksydaza, który wiąże się z biotyną na koniugatach.

Umyj ponownie, a następnie dodaj podłoże chromogenne, które jest utleniane przez peroksydazę, aby wytworzyć brązowy osad. Zatrzymaj reakcję za pomocą PBS.

Przenieś sekcje na szkiełko pokryte żelatyną i odwadnij je za pomocą zwiększających się stężeń etanolu. Następnie oczyść sekcje z ksylenu i zamontuj je.

Umieść szkiełko pod mikroskopem jasnego pola.

Pod wpływem światła, niebarwione obszary przepuszczają światło i wydają się jasne, podczas gdy wybarwione neurony pochłaniają i odbijają światło i wydają się ciemniejsze.

Wyraźny ciemniejszy obszar wskazuje na aktywację neuronów w hipokampie.

Przenieś od trzech do pięciu grzbietowych odcinków hipokampa dla każdej myszy do studzienek 24-dołkowej płytki zawierającej 500 mikrolitrów 0,1 molowego PBS na każdą studzienkę. Umyj skrawki zawarte w każdej studzience 500 mikrolitrami 0,1 molowego PBS. Wszystkie mycia i inkubacje należy wykonywać w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem, chyba że zaznaczono inaczej. Pod wyciągiem inkubować skrawki w 40% metanolu, 1% nadtlenku wodoru w 0,1 molowym PBS przez 20 minut w celu wygaszenia endogennej aktywności peroksydazy.

Po trzech kolejnych płukaniach w 0,1 molowym PBS, przepuszczalność skrawków poprzez inkubację w 500 mikrolitrach 0,2% Triton X-100 przez pięć minut. Podczas inkubacji sekcji przygotuj wystarczającą ilość bufora blokującego na cały eksperyment. Następnie usuń roztwór przepuszczalny i dodaj 100 mikrolitrów buforu blokującego do każdej studzienki. Inkubuj sekcje przez godzinę.

Następnie usuń bufor blokujący i przykryj skrawki fosforylowanym przeciwciałem pierwszorzędowym kinazy regulowanej zewnątrzkomórkowo, rozcieńczonym od 1 do 500 w buforze blokującym. Skrawki inkubować przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza, delikatnie mieszając. Następnego dnia, po trzykrotnym umyciu skrawków w 0,1 molowym PBS przez 5 minut każda, inkubować skrawki z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z biotyną rozcieńczonym buforem blokującym od 1 do 250 przez godzinę w temperaturze pokojowej.

Podczas inkubacji należy przygotować odczynnik ABC co najmniej 30 minut przed użyciem, aby zapewnić wystarczająco dużo czasu na wytworzenie się kompleksu awidyny i biotyny. Po trzykrotnym przemyciu skrawków 0,1-molowym PBS, dodać odczynnik ABC i pozostawić do inkubacji z próbką przez 45 minut. Podczas kolejnej serii trzech płukań w PBS przygotuj roztwór roboczy do dabowania w dygestoriach zgodnie ze specyfikacją producenta. Porcję roztworu roboczego do dab umieścić na płytce.

Następnie przenieś skrawki do studzienek zawierających roztwór roboczy DAB i powoli obracaj płytką, aby umożliwić maksymalne wystawienie sekcji na działanie roztworu. Monitoruj reakcję DAB pod mikroskopem, aż w ciągu około dwóch do pięciu minut pojawi się odpowiedni sygnał. Zatrzymaj reakcję przy pożądanej intensywności koloru, myjąc tkankę w 0,1 molowym PBS. Po trzech kolejnych praniach w PBS zamontuj sekcje na szkiełkach pokrytych żelatyną i susz je w temperaturze pokojowej przez co najmniej trzy do czterech godzin.

Po wysuszeniu powietrzem przenieś szkiełka do dygestorium i odwodnij sekcje, sekwencyjnie umieszczając je w stopniowanych roztworach etanolu na dwie minuty każda. Następnie wyczyść szkiełka w 100% ksylenach przez pięć minut. Nakryj szkiełka za pomocą podłoża montażowego i pozostaw je na noc w dygestoriach do wyschnięcia.

Przenieś szkiełka do mikroskopu jasnego pola wyposażonego w kamerę w obiektywie 20x. Uzyskaj wiele obrazów w jasnym polu z każdej sekcji w 200-krotnym powiększeniu, obejmujących grzbietowy hipokamp. Wyobraź sobie od trzech do pięciu sekcji z każdego zwierzęcia.