Obrazowanie wewnątrzkomórkowej dynamiki ATP za pomocą czujników opartych na FRET w organotypowym wycinku hipokampa myszy

Zabezpiecz organtypowy plaster hipokampa myszy w komorze doświadczalnej.

Wycinek zawiera transdukowane neurony i astrocyty wyrażające czujnik ATP z białkami fluorescencyjnymi dawcy i akceptora.

Umieść komorę na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego i przeprowadź ją za pomocą natlenionego ACSF.

Pozwól plasterkowi dostosować się do warunków buforowania.

Używając światła transmisyjnego, skup plasterek i zidentyfikuj obszar zainteresowania.

Przełącz na tryb fluorescencji i wzbudz białko fluorescencyjne dawcy, aby zainicjować emisję fluorescencji.

Po związaniu ATP, czujnik ulega zmianom konformacyjnym, umożliwiając oparty na fluorescencji transfer energii od dawcy do akceptora, który emituje fluorescencję na dłuższym fali.

Użyj dichroicznego lustra i filtrów pasmowoprzepustowych, aby wyizolować i oddzielić emisje donorów i akceptorów.

Wybierz region bez fluorescencji do odejmowania tła. Następnie zidentyfikuj komórki docelowe i zarejestruj ich fluorescencję w czasie.

Oblicz współczynnik FRET, aby monitorować wewnątrzkomórkowe poziomy ATP w czasie rzeczywistym.

Przygotować eksperymentalny ACSF i uzyskać pH 7,4 poprzez bulgotanie go 95% tlenem i 5% dwutlenkiem węgla przez włożony rurkę podłączoną d