Obrazowanie fluorescencyjne dynamiki neuroimmunologicznej za pomocą implantu czaszki

Zacznij od znieczulonej myszy transgenicznej z okrągłym szklanym okienkiem obrazowania i płytką na głowę wszczepioną na jej czaszkę.

Komórki mikrogleju lub układu odpornościowego oraz neurony są znakowane białkami fluorescencyjnymi.

Następnie przymocuj mysz do stolika mikroskopu dwufotonowego.

Następnie wstrzyknij dootrzewnowo barwnik fluorescencyjny, aby zabarwić naczynia krwionośne na czerwono.

Wyczyść szklane okienko obrazowania, nałóż kroplę soli fizjologicznej i opuść obiektyw mikroskopu.

Następnie ustaw światło lasera, aby uchwycić obraz naczyń krwionośnych. Zapisz wzór rozgałęzień i współrzędne, aby później zlokalizować i zobrazować ten sam region.

Teraz ustaw laser tak, aby wzbudzał białka fluorescencyjne, powodując fluorescencję mikrogleju i neuronów.

Korzystając z zarejestrowanego wzoru rozgałęzień, zlokalizuj ten sam region i regularnie rejestruj obrazy komórek.

Sieć naczyniowa i neurony pozostają stabilne, podczas gdy zmiany pozycji mikrogleju w czasie odzwierciedlają dynamikę immunologiczną w odpowiedzi na aktywność neuronów.

Wywierć okrągły otwór około 4 milimetry w głąb czaszki za pomocą wiertła dentystycznego. Podczas wiercenia regularnie zwilżaj czaszkę sterylną solą fizjologiczną i wacikami, aby schłodzić mózg. Usuń resztki kości i zmiękcz kość czaszki.

Po zakończeniu ostrożnie usuń tę część czaszki za pomocą spiczastych kleszczy. Po usunięciu czaszki ostrożnie umieść małą szklankę nakrywkową zwilżoną solą fizjologiczną w kraniotomii. Osusz nadmiar soli fizjologicznej za pomocą sterylnej chusteczki. Za pomocą spiczastego aplikatora nałóż klej cyjanoakrylowy wokół okna i pozwól mu przymocować się do mózgu i czaszki.

Nałóż klej podkładowy na resztę czaszki i utwardź go światłem utwardzającym przez 20 do 40 sekund. Za pomocą końcowego kleju utwardź zagłębienie wokół okna i utwardź je lampą utwardzającą przez 20 do 40 sekund. Przyklej małą płytkę głowy do czaszki na przeciwległej półkuli kraniotomii za pomocą kleju podkładowego, a następnie za pomocą końcowego kleju utwardzaj obie przez 20 do 40 sekund.

Po przebudzeniu myszy wstrzyknij jedną podskórną dawkę buprenorfiny SR jako znieczulenie pooperacyjne, które wystarczy na 72 godziny. Zapewnij myszy dodatkowe miękkie jedzenie, aby ułatwić zdrową regenerację. Obrazowanie można wykonać już po dwóch tygodniach od zabiegu implantacji. Użyj, aby zamontować płytkę głowicy na stoliku mikroskopu dwufotonowego, który powinien być utrzymywany w temperaturze 35 stopni Celsjusza za pomocą płyty grzewczej.

Wstrzyknij mysz podskórnie 100 mikrolitrów barwnika do naczyń krwionośnych, takiego jak rodamina B. Delikatnie oczyść powierzchnię okna czaszki bawełnianym wacikiem nasączonym 70% etanolem. Wlej kilka kropel wody lub soli fizjologicznej na szybę i opuść soczewkę obiektywu do roztworu. Upewnij się, że laser jest wyłączony, gdy obiektyw się obniża.

Ręcznie narysuj mapę kursu, aby oznaczyć główne punkty orientacyjne naczyń krwionośnych, patrząc przez okular. Użyj tego rysunku, aby zidentyfikować określone obszary podczas obrazowania dwóch fotonów. Zbieraj obrazy fluorescencyjnych komórek i naczyń krwionośnych za pomocą obrazowania dwufotonowego. Zapoznaj się z rękopisem tekstowym, aby zapoznać się z parametrami obrazowania. Rób dokładne notatki z odpowiednimi współrzędnymi, aby upewnić się, że dokładne obszary mogą zostać ponownie odwiedzone w celu późniejszego obrazowania.

Zbierz kilka pól widzenia podczas tej początkowej sesji obrazowania.