JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 2:48 min. • May 29th, 2025
Zacznij od zestawu mikroskopu fluorescencyjnego zawierającego unieruchomioną membranę z nerwami przeponowymi od transgenicznej myszy.
Połączenie nerwowo-mięśniowe przepony składa się z neuronu ruchowego, włókna mięśniowego i komórek Schwanna zawierających receptory acetylocholiny i kanały wapniowe.
Komórki te mają znakowane fluorescencyjnie receptory acetylocholiny i wyrażają wewnątrzkomórkowe wskaźniki wapnia.
Dołączony do zestawu rozdzielacz obrazu umożliwia jednoczesną wizualizację obu sygnałów fluorescencyjnych.
Nerw przeponowy jest umieszczony w elektrodzie ssącej w celu dostarczania bodźca elektrycznego.
Pod mikroskopem fluorescencyjnym uwidocznij receptory acetylocholiny, aby zidentyfikować połączenie nerwowo-mięśniowe.
Aby ustawić maksymalną podstawową fluorescencję, dodaj roztwór chlorku potasu, aby tymczasowo zdepolaryzować błonę komórkową. Powoduje to wewnątrzkomórkowy napływ wapnia, powodując wzrost fluorescencji wskaźników.
Dostosuj ustawienia jasności, aby zapobiec przesyceniu sygnału fluorescencji.
Po repolaryzacji zastosuj stymulację elektryczną, aby wywołać napływ wapnia do komórki i zarejestrować zmianę fluorescencji wewnątrzkomórkowej z dużą szybkością klatek.
Przy 20-krotnym powiększeniu zlokalizuj pasmo płytki końcowej w środku mięśnia, szukając fluorescencyjnie znakowanych połączeń nerwowo-mięśniowych alfa-bungarotoksyny pod wzbudzeniem zielonym żółtym światłem. Przełącz się na wzbudzenie światłem niebieskim, aby zobrazować reakcje wapnia w mięśniach, neuronach ruchowych lub komórkach Schwanna. W tym przykładzie GCaMP 3 ulega ekspresji w komórkach mięśniowych.
W razie potrzeby skonfiguruj rozdzielacz obrazu z filtrami pasmowoprzepustowymi i dichroicznym filtrem jednokrawędziowym do obrazowania o podwójnej długości fali. Wykonuj eksperymenty z paskiem jasności na pasku tabeli przeglądowej, ustawionym na 110% poziomu, przy którym genetycznie kodowany wskaźnik wapnia wyrażający tkankę wykazuje nasycenie przy 20-krotnym powiększeniu, bez kategoryzacji w odpowiedzi na chlorek potasu.
Nagrywaj z prędkością 20 klatek na sekundę, aby nie przegapić żadnych szybkich wydarzeń. Stymuluj stymulacją nerwów od 1 do 45 sekund od 20 do 40 Hz, dostarczając ciąg impulsów za pomocą elektrody ssącej. I zbieraj dynamiczne fluorescencyjne odpowiedzi wapnia w jednym podtypie komórki, wraz ze statycznym, znakowanym fluorescencyjnie sygnałem połączenia nerwowo-mięśniowego alfa-bungarotoksyny.