Dwukolorowe, stymulowane obrazowanie rozpraszania Ramana tkanki mózgowej myszy

Weź wycinek mózgu myszy w komorze na szkiełku i umieść go pod mikroskopem ze stymulowanym systemem obrazowania rozpraszania Ramana lub SRS.

Skoncentruj dwie zsynchronizowane wiązki laserowe, znane jako pompa i wiązki Stokesa, na tkance.

Różnica energii między tymi wiązkami odpowiada częstotliwości drgań określonych cząsteczek, indukowanie drgań molekularnych.

Pobudzaj lipidy i białka tkankowe, mające unikalne wibracje molekularne, używając odrębnych par częstotliwości zsynchronizowanych wiązek.

Wzbudzenie ułatwia przenoszenie energii między wiązkami, zmniejszając intensywność wiązki pompy, jednocześnie zwiększając intensywność wiązki Stokesa.

Względna zmiana intensywności jest wykrywana jako sygnał SRS, który pomaga zidentyfikować cząsteczki.

Fotodetektor zbiera połączone sygnały SRS z próbki.

Przypisz sygnałom lipidowym i białkowym oddzielne kolory, tworząc dwukolorowy obraz, aby zidentyfikować białka i lipidy w tkance mózgowej.

Umieść próbnik wiązki w ścieżce wiązki stokes, aby pobrać 10% wiązki. I wyślij go do szybkiej fotodiody, aby wykryć 8-megahercowy ciąg impulsów. Weź jedno z wyjść bufora fanout i przefiltruj je filtrem pasmowoprzepustowym, aby uzyskać falę sinusoidalną o częstotliwości 20 megaherców. Następnie użyj tłumika RF, aby dostosować napięcie szczytowe wejścia/wyjścia do napięcia szczytowego do około 500 miliwoltów. Wyślij wynikowe wyjście do przesuwnika fazowego, który umożliwia precyzyjną regulację fazy RF za pomocą źródła napięcia.

Wyślij to wyjście do wzmacniacza mocy RF i podłącz wyjście amplifier do EOM. Po odblokowaniu wiązki stokesów zoptymalizuj głębokość modulacji pierwszego EOM, umieszczając fotodiodę na ścieżce wiązki. Dostosuj napięcie EOM i płytkę ćwierćfalową, aż głębokość modulacji będzie wydawać się zadowalająca. Umieść fotodiodę za lustrem dichroicznym, aby wykryć wiązkę laserową. Najpierw zablokuj wiązkę stokes. Następnie powiększ jeden z pików impulsów pompy na oscyloskopie. Umieść pionowy kursor, aby zaznaczyć czasowe położenie tego piku za pomocą oscyloskopu.

Teraz zablokuj belkę pompy i odblokuj belkę stokes. Przetłumacz stopień opóźnienia, aby tymczasowo dopasować pozycje szczytowe na oscyloskopie do pozycji zaznaczonej w poprzednim kroku, obliczając odległość opóźnienia wymaganą do dopasowania dwóch wiązek, a następnie wydłużając tor wiązki szybszej wiązki lub skracając tor wiązki wolniejszej wiązki.

Następnie przygotuj próbkę szkiełka mikroskopowego z DMSO i taśmą dwustronną jako przekładką, aby utrzymać próbkę między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym. Umieść próbkę na mikroskopie stroną z szkiełkiem nakrywkowym skierowaną w stronę obiektywu mikroskopu i obserwuj próbkę z okularu w jasnym oświetleniu. Znajdź ognisko próbki zarówno w górnej, jak i dolnej warstwie pęcherzyków powietrza na granicy faz taśmy szklanej. Następnie przesuń ostrość tak, aby znajdowała się między dwiema warstwami taśmy.

Następnie ustaw wejście/wyjście przestrajalnej wiązki na 798 nanometrów. Opierając się na przepustowości optycznej kondensatora, dostosuj moc optyczną tak, aby wynosiła około 40 miliwatów każda dla pompy i kieruje wiązki na ognisko obiektywu. Następnie otwórz zeskanowany obraz w Matlabie i kliknij przycisk oznaczony Focus, aby rozpocząć skanowanie. Wyreguluj lusterko kierownicze przed skanerem galvo, aby wyśrodkować sygnał DC na wyświetlaczu kanału 1.

Przesuń zmotoryzowany stopień opóźniający i uważnie obserwuj blokadę wyjścia pokazaną na wyświetlaczu kanału drugiego. Na koniec dostosuj opóźnienie czasowe, aby zmaksymalizować intensywność sygnału AC. Wyreguluj zwierciadło dichroiczne, aby wyśrodkować sygnał SRS na kanale AC. Następnie wyreguluj fazę blokady we wzmacniaczu, aby zmaksymalizować sygnał.

Po zamontowaniu próbki wsuń na mikroskop i dostosuj moc obu wiązek do około 40 miliwatów każda przy ogniskowaniu próbki, jak pokazano wcześniej, otwarty obraz skanowania z Matlaba. Następnie znajdź maksymalny sygnał SRS, skanując przez stopień opóźniający odpowiadający 2913 odwrotnemu centymetrowemu pikowi Ramana DMSO.

Uzyskaj obraz SRS odpowiadający pikowi Ramana o długości 2913 odwróconych centymetrów DMSO. Otwórz obraz w ImageJ i wybierz mały obszar na środku ramki. Funkcja miary służy do obliczania średniej i odchylenia standardowego wartości w wybranym obszarze. Aby uzyskać kalibrację osi częstotliwości, zapisz skan hiperspektralny z zakresem stopnia opóźnienia obejmującym 2,913 i 2,994 odwrotne centymetry szczytów Ramana DMSO.

Następnie zapisz pozycje stołu montażowego odpowiadające zestawowi danych hiperspektralnych. Wykonaj regresję liniową dla pozycji sceny i przesunięć Ramana o 2,913 i 2,994 centymetry odwrotne. Korzystając z równania regresji liniowej, przekształć pozycje opóźnienia na odpowiadające im częstotliwości Ramana. W celu kalibracji rozdzielczości spektralnej należy oszacować pozycję stolika na podstawie poprzedniej pozycji ze zwiększoną długością ścieżki optycznej spowodowaną wstawieniem prętów. Wyrównaj przestrzenne nakładanie się belki ze względu na niewielkie odchylenie belki podczas dodawania prętów szklanych.

Zainstaluj rozdzielacz wiązki polaryzacyjnej, płytkę ćwierćfalową i drugi EOM w ścieżce wiązki stokes po pierwszym EOM. Odłącz wejście sygnału od drugiego EOM. Następnie podłącz wejście sygnału do pierwszego EOM i włącz go. Moduluj wiązkę stokesów w megahercach, wysyłając wiązkę przez pierwszy EOM. Dostosuj nachylenie i położenie pierwszego EOM, aby upewnić się, że wiązka jest wyśrodkowana przez kryształ EOM. Przygotuj próbkę wycinka tkanki za pomocą taśmy dwustronnej, szkiełka mikroskopowego i szkła nakrywkowego.

Umieść próbkę na mikroskopie stroną z szkiełkiem nakrywkowym skierowaną w stronę obiektywu mikroskopu. W przypadku obrazowania SRS w trybie Epi zainstaluj płytkę półfalową, zanim wiązka wejdzie do mikroskopu, aby zmienić polaryzację wiązki trafiającej do mikroskopu. Umieść rozdzielacz wiązki polaryzacyjnej nad obiektywem, aby zdepolaryzowana wiązka odbita wstecznie mogła dotrzeć do detektora.

Następnie użyj soczewki achromatycznej 75 i milimetrowej soczewki asferycznej, aby przekazać rozproszone wstecznie fotony z tylnej apertury obiektywu do fotodetektora. Zamontuj detektor, aby zebrać światło rozproszone wstecznie kierowane przez rozdzielacz wiązki polaryzacyjnej. Następnie zainstaluj filtr, aby zablokować modulowaną wiązkę przed wejściem do detektora.