JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 2:19 min • May 29th, 2025
Zacznij od oczyszczonej tkanki hipokampa myszy, która staje się optycznie przezroczysta poprzez usunięcie lipidów. Tkanka jest osadzona w siatce hydrożelowej w celu stabilizacji biomolekuł i zachowania struktur komórkowych.
Tkanka zawiera astrocyty wyrażające czerwone białko fluorescencyjne i neurony pobudzające wyrażające zielone białko jądrowe, co umożliwia wyraźną wizualizację.
Umieść tkankę na szkiełku i stwórz komorę za pomocą gorącego kleju, pozostawiając niewielką szczelinę.
Zastosuj roztwór dopasowujący współczynnik załamania światła, aby nawodnić tkankę i zapobiec pęcherzykom, a następnie uszczelnij szkiełkiem nakrywkowym.
Wypełnij komorę roztworem dopasowującym współczynnik załamania światła, aby zmniejszyć rozpraszanie światła i zamknąć szczelinę.
Wizualizacja tkanki za pomocą mikroskopu dwufotonowego.
Światło bliskiej podczerwieni wzbudza czerwone i zielone białka fluorescencyjne w płaszczyźnie ogniskowej, umożliwiając obrazowanie w wysokiej rozdzielczości przy minimalnym fotouszkodzeniu. Emisje fluorescencji są wykrywane oddzielnie, co wyraźnie ujawnia przestrzenną bliskość między astrocytami a jądrami neuronów pobudzających.
Najpierw umieść próbkę na środku szkiełka. Za pomocą gorącego kleju utwórz ścianki na krawędziach zjeżdżalni, prawie tak wysokie jak tkanka. Upewnij się, że zostawiłeś niewielką szczelinę w jednym z rogów. Gdy gorąca warstwa kleju zbliża się do wysokości wycinka mózgu, nałóż jedną lub dwie krople roztworu dopasowującego współczynnik załamania światła na próbkę, aby zwilżyć górną powierzchnię i zapobiec tworzeniu się pęcherzyków.
Gdy gorący klej jest jeszcze płynny, uszczelnij górę szkiełkiem nakrywkowym, układając ją tak równomiernie, jak to możliwe. Następnie napełnij komorę roztworem dopasowującym współczynnik załamania światła. Zamknij szczelinę gorącym klejem. Jeśli ścianki gorącego kleju wystają poza granice prowadnicy, przytnij krawędzie przedłużające. Jeśli do obrazowania używany jest obiektyw immersyjny z olejkiem, dodaj kolejne dwa do trzech milimetrów kleju na ścianki nad szkiełkiem nakrywkowym, aby zachować roztwór zanurzeniowy. Po tym protokole tkanka mózgowa zostanie oczyszczona.