Kwantyfikacja nowo wygenerowanych neuronów w tkance mózgowej szczura przy użyciu techniki frakcjonowania optycznego

Weźmy wycinki mózgu hipokampa od szczura, któremu wstrzyknięto bromodeoksyurydynę lub BrdU, nukleozydowy analog tymidyny.

BrdU integruje się z DNA podczas podziału komórki, znakując nowo wygenerowane neurony w zakręcie zębatym, regionie neurogenezy.

Inkubuj ze środkiem utleniającym, aby dezaktywować endogenne enzymy peroksydazy.

Potraktuj kwasem, aby zdenaturować DNA i odsłonić BrdU, a następnie zneutralizować kwas.

Inkubować z detergentem w celu przepuszczalności błon komórkowych i roztworem blokującym w celu zamaskowania niespecyficznych miejsc wiązania.

Inkubować z pierwszorzędowymi przeciwciałami skierowanymi przeciwko BrdU, a następnie z przeciwciałami drugorzędowymi znakowanymi peroksydazą specyficznymi dla przeciwciał pierwszorzędowych.

Wprowadź chromogenny substrat i środek utleniający, umożliwiając peroksydazie przekształcenie substratu w kolorową pozostałość.

Zamontuj tkankę i przeciwbarwić barwnikiem wiążącym kwas nukleinowy.

Odwodnić tkankę, a następnie potraktować ją, aby zwiększyć przezroczystość.

Pod mikroskopem zidentyfikuj zakręt zębaty.

Korzystając z techniki frakcjonowania optycznego, przeanalizuj wiele płaszczyzn w poprzek grubości tkanki, aby określić ilościowo neurony znakowane BrdU.

Gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia, barwienie immunologiczne, pozwól, aby skrawki osiągnęły temperaturę pokojową. Następnie za pomocą pędzla przenieś co piątą sekcję z serii odcinków hipokampa do 25-dołkowych siatek barwiących umieszczonych na szalkach Petriego wypełnionych PBS. Na hipokamp powinno przypadać od 8 do 12 sekcji do barwienia. Przenieść siatki barwiące zawierające skrawki do pasujących naczyń szklanych zawierających PBS i umyć skrawki dwukrotnie przez 10 minut w PBS.

Następnie inkubować w 3% nadtlenku wodoru przez 20 minut. Po umyciu przepuść sekcje przez trzy roztwory kwasu solnego. Następnie zneutralizować w 0,1 molowym tetraboranie sodu w temperaturze pokojowej przez 20 minut.

Po trzech 10-minutowych inkubacjach w zmieniających się płuczących przenieść skrawki do roztworu blokującego na jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie inkubować skrawki w mysim anty-BrdU, rozcieńczonym od 1 do 100 w roztworze blokującym przez 48 godzin w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Po inkubacji przeciwciał pierwotnych przemyć trzy razy przez 10 minut każdy w buforze myjącym, a następnie inkubować przez 48 godzin w peroksydazie chrzanowej, rozcieńczonej od 1 do 10 w buforze do mycia. 48 godzin później przenieść skrawki do PBS na 10 minut i powtórzyć w sumie pięć płukań. Po umyciu przenieś skrawki do roztworu DAB na siedem minut. Następnie przenieś do roztworu DAB zawierającego 0,02% nadtlenku wodoru na 10 minut.

Po serii myć zamontuj sekcje w kolejności numerycznej na szkiełkach mikroskopowych. Pozostawić do wyschnięcia na około 30 minut. Następnie wysusz próbki na powietrzu, umieszczając je w stojaku na szkiełka. Następnie należy ponownie nawodnić próbki przez 10 minut w naczyniu do barwienia szkiełek zawierających wodę destylowaną.

Następnie przenieś szkiełka do 0,02% fioletu krystalicznego w wodzie destylowanej na 15 minut. Po powtórzeniu barwienia fioletem krystalicznym należy ponownie nawodnić skrawki za pomocą serii etanolu. Następnie oczyść skrawki z ksylenu dwa razy przez 15 minut za każdym razem. Na koniec dodaj szybkoschnące podłoże montażowe i nakryj szkiełka.

Po 24 godzinach szkiełka można wykorzystać do mikroskopii. Zacznij od sprawdzenia grubości tkanki, najpierw umieszczając szkiełka na zmotoryzowanym stoliku mikroskopu, a następnie otwierając oprogramowanie stereologiczne. Określ obszar zainteresowania za pomocą obiektywu o małym powiększeniu, zanim zmienisz obiektyw na 100-krotny zanurzenie w olejku.

Następnie wybierz określony punkt w ramce rozliczeniowej, na przykład obszar przylegający do narożnika, i zlokalizuj górną część sekcji, przesuwając się wzdłuż płaszczyzny ogniskowej, aż jakiś element przekroju stanie się ostry. Zarejestruj tę pozycję z jako 0. Następnie przesuń płaszczyznę ogniskowej w dół przez tkankę, aż ostatni poziom z tkanki będzie ostry, a następnie zaznacz tę pozycję. Lokalna grubość tkanki jest definiowana od 0 do tego punktu końcowego i można ją odczytać na osi z.

Zarejestruj grubość tkanki. Grubość tkanki jest mierzona w kilku miejscach w obszarze zainteresowania. Wysokość dysektora i stref ochronnych, wielkość zliczania, długość klatki, a końcowe powiększenie określa się w badaniu pilotażowym. Teraz możesz zacząć liczyć neurony BrdU-dodatnie, zwykle w końcowym powiększeniu od 2000 do 3000x, używając obiektywu z olejkiem 60x lub obiektywu olejowego 100x i z dużą aperturą numeryczną.

Zidentyfikuj neurony BrdU-dodatnie w każdej ramce liczenia, ale nie licz tych, które dotykają czerwonej linii wykluczenia. Policz te neurony BrdU-dodatnie, które dotykają zielonej linii inkluzji, i te, które mieszczą się w granicach ramki liczenia. Neurony BrdU-dodatnie należy liczyć tylko wtedy, gdy cecha będąca przedmiotem zainteresowania jest wyraźnie rozpoznawalna w obrębie wysokości dyssektora. Pokazane tutaj częściowo widoczne neurony nie są liczone.