Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Zacznij od transgenicznej poczwarki Drosophila z odsłoniętym okiem.

Umieść poczwarkę na galaretki w uwodnionej papierowej ramce, otoczonej galaretkowym pierścieniem.

Oko poczwarki zawiera białka połączeniowe znakowane GFP, które podkreślają granice komórek w rozwijającym się nabłonku oka .

Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe w okolicę oka poczwarki.

Pod mikroskopem fluorescencyjnym połączenia oznaczone GFP fluoryzują, ukazując organizację nabłonka nerwowego.

Rób zdjęcia w regularnych odstępach czasu na różnych głębokościach i przetwarzaj je, aby zwiększyć kontrast i zminimalizować szumy tła.

Dopasuj te obrazy do rosnących odstępów czasu, aby śledzić rozwijający się nabłonek nerwowy.

Początkowo komórki pierwotne tworzą granice wokół klastrów komórek fotoreceptorów, podczas gdy komórki międzyommatydialne lub układy scalone układają się w jedną warstwę.

Później układy scalone różnicują się w komórki drugorzędowe i trzeciorzędowe w pobliżu fotoreceptorów.

Wreszcie, nadmiar układów scalonych jest usuwany poprzez zaprogramowaną śmierć komórki, tworząc sześciokątną siatkę, która strukturyzuje zorganizowane oko.

Za pomocą kleszczy ostrożnie podnieś i wyjmij wieczko, aby odsłonić głowę poczwarki. Następnie rozerwij wzdłuż boku koperty poczwarki, aby odsłonić obszar wokół jednego oka. Delikatnie usuń poczwarkę z taśmy klejącej.

Zbuduj małą ramkę o powierzchni 15 milimetrów kwadratowych z bibuły i wybij 5-milimetrowy otwór w środku. Zanurz ramkę w wodzie destylowanej i umieść ją na środku szkiełka mikroskopowego. Za pomocą strzykawki o pojemności 30 ml wyciśnij jednolity pierścień wazeliny, aby otoczyć ramkę bibuły.

Następnie dodaj małą kulkę wazeliny bezpośrednio na szkiełko. Ostrożnie ułóż poczwarkę na boku i podeprzyj ją kulką wazeliny. Umieść szkiełko nakrywkowe na pierścieniu wazeliny tak, aby stykało się z nabłonkiem nad okiem. Delikatnie ściśnij preparat, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe z wazeliną i wytworzyć małą, płaską powierzchnię kontaktową między obszarem źrenicy a szkiełkiem nakrywkowym.

Zobrazuj preparat poczwarki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Rejestruj seryjne odcinki przez domenę wierzchołkową neuroepitelium oka w okolicy połączenia przylegającego co siedem minut. Użyj odpowiedniego oprogramowania do dekonwolucji, aby zmniejszyć tło i zwiększyć kontrast obrazów sekcji szeregowej.

Dla każdego pliku stosu z w oprogramowaniu LAS AF przejdź do panelu Narzędzia, wybierz opcję Dekonwolucja 3D i kliknij przycisk Zastosuj. Wygeneruj maksymalną projekcję lub obraz MP dla każdego pliku stosu bez zawiłości. Algorytmy wbudowane w program Photoshop CS5 można wyrównać do każdego obrazu MP, aby podkreślić zachowania poszczególnych komórek i zmniejszyć rozproszenie uwagi spowodowane wzrostem organizmów.

Na karcie Plik w menu głównym otwórz Skrypty i wybierz opcję Załaduj pliki do stosu. Następnie zaimportuj pliki obrazów MP do panelu Wczytaj warstwy. Upewnij się, że opcja Próba automatycznego wyrównania obrazów źródłowych nie jest zaznaczona, w przeciwnym razie dane obrazu mogą być zniekształcone. Po załadowaniu wszystkich plików MP do panelu warstw sprawdź, czy wszystkie obrazy są w porządku chronologicznym i czy najwcześniejszy punkt czasowy znajduje się na górze stosu warstw. W razie potrzeby przeciągnij i upuść, aż zostaną poprawnie uporządkowane.

Następnie wybierz opcję Automatycznie wyrównaj warstwy. Wybierz opcję Zmień położenie i kliknij przycisk OK.