Podłużne obrazowanie dwufotonowe znakowanych fluorescencyjnie neuronów w żywym hipokampie myszy

Weźmy znieczuloną transgeniczną mysz wykazującą ekspresję białek fluorescencyjnych w rzadkich neuronach piramidowych.

Mysz jest wszczepiana z kaniulą obrazującą nad grzbietowym hipokampem.

Umieść mysz pod mikroskopem dwufotonowym na poduszce grzewczej, mocując płytkę główki kaniuli do uchwytu, aby unieruchomić jej głowę.

Zastosuj maść, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.

Oczyść kaniulę wodą dejonizowaną i sprawdź ją pod obiektywem o małym powiększeniu, aby sprawdzić, czy nie ma zanieczyszczeń, uszkodzeń lub problemów z fluorescencją.

Dopasuj kaniulę obrazowania do osi optycznej mikroskopu, aby uzyskać precyzyjne obrazowanie.

Następnie przełącz się na obiektyw o wysokiej rozdzielczości zanurzony w wodzie.

Napełnij kaniulę wodą dejonizowaną, upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza, aby uniknąć zniekształceń obrazu.

Wykonaj dwufotonowe obrazowanie podłużne za pomocą światła podczerwonego, aby selektywnie wzbudzić fluorofory w płaszczyźnie ogniskowej, umożliwiając obrazowanie głębokich tkanek.

Wszczepiona kaniula ułatwia wielokrotny dostęp do grzbietowego hipokampa w celu śledzenia zmian dendrytycznych w czasie.

Umieść mysz pod mikroskopem nad dywanem grzewczym i przymocuj płytę głowicy do uchwytu. Nałóż maść do oczu na oczy zwierzęcia. Następnie wyczyść kaniulę obrazowania za pomocą strzykawki i cienkiej igły, aby wkroplić dejonizowaną wodę do kaniuli, a następnie usuń ją za pomocą pompy próżniowej.

Używaj obiektywów o małym powiększeniu i dużej odległości roboczej, aby wizualnie sprawdzić kaniulę pod kątem resztek wody, brudu, integralności i obecności fluorescencji. Następnie dopasuj kaniulę do osi optycznej, regulując kąty ramion uchwytu głowy.

Przełącz się na obiektyw 25x z aperturą numeryczną 1,0 i 4-milimetrową odległością roboczą. Następnie dodaj tyle wody dejonizowanej do kaniuli, aby ją napełnić i utrzymać nadmiar wody na wierzchu kaniuli. Na koniec użyj wzbudzenia dwoma fotonami i zobrazuj sygnały fluorescencyjne.