Monitorowanie odzyskiwania komórek międzynerwowych ablowanych laserowo u danio pręgowanego za pomocą mikroskopii konfokalnej

Zacznij od larwy danio pręgowanego zawierającej znakowane fluorescencyjnie komórki międzynerwowe lub INMC, zamontowanej na szkiełku nakrywkowym i umieszczonej pod mikroskopem konfokalnym.

INMC to komórki progenitorowe o zdolnościach regeneracyjnych, które zostały wcześniej poddane ablacji laserowej.

Najpierw obserwuj uszkodzony obszar w trybie fluorescencji. Brak fluorescencji potwierdza udaną ablację laserową.

Następnie użyj trybu obrazowania w świetle przechodzącym, aby zbadać uszkodzony obszar, w którym komórka wydaje się ziarnista i spuchnięta z nieregularnymi jądrami, potwierdzając śmierć komórki.

Rekrutacja makrofagów do tego miejsca wskazuje na aktywną odpowiedź komórkową na uraz.

Teraz przełącz się z powrotem na tryb fluorescencji i rób zdjęcia poklatkowe w regularnych odstępach czasu, aby monitorować regenerację.

W fazie odzyskiwania INMC rozszerzają projekcje w lukę, ułatwiając zamknięcie i promując naprawę komórkową.

Zapisz te obrazy szeregów czasowych do analizy. Ponowne pojawienie się wyraźnej fluorescencji w obszarze po ablacji potwierdza pomyślną regenerację komórek.

Aby zobrazować ciała komórek po ablacji, w menu Kanały odznacz ścieżkę DAPI, aby dezaktywować laser ablacyjny i otwórz menu trybu akwizycji. Kliknij przycisk Zoom (Powiększenie) i zmniejsz powiększenie do 0,7.

Aby ocenić powodzenie ablacji komórek, należy szybko zeskanować pole widzenia. Korzystając z tych samych ustawień, co w przypadku obrazowania przed ablacją, uchwyć i zapisz obraz po ablacji. Sprawdź obraz kanału fotopowielacza światła przechodzącego, aby dodatkowo potwierdzić uszkodzenie komórki. Uszkodzone komórki będą miały ziarnisty wygląd, a jądra często pęcznieją lub wydają się mieć nieregularny kształt.

Aby ocenić regenerację ciała komórki po ablacji, aktywuj zarówno pozycję stolika, jak i opcje czasu przechwytywania obrazu poklatkowego, a następnie ustaw parametry czasu na odpowiedni eksperymentalny punkt czasowy i 15-minutowe odstępy. Następnie rozpocznij eksperyment, aby uzyskać obrazy i zapisać wynikowy plik po zakończeniu.