Obrazowanie wapnia in vitro w krótko- i długoterminowych hodowlach hipokampa szczurów

Weźmy krótkoterminową hodowlę neuronów hipokampa szczura reprezentującą młode neurony i długoterminową hodowlę reprezentującą starzejące się neurony.

Starzejące się neurony wykazują większą gęstość kanałów wapniowych bramkowanych napięciem typu L lub L-VGCC, które pozostają otwarte przez dłuższy czas po depolaryzacji błony.

Inkubuj z fluorescencyjnym wskaźnikiem wapnia, który dyfunduje do komórek, a następnie umyj, aby usunąć nadmiar barwnika.

Umieść kultury w komorze perfuzyjnej pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Wprowadź roztwór zawierający neuroprzekaźniki, które wiążą się z receptorami na neuronach, indukując napływ jonów sodu i wywołując depolaryzację błony.

Depolaryzacja aktywuje L-VGCC, umożliwiając napływ wapnia do cytoplazmy.

W hodowli długotrwałej większa gęstość i przedłużone otwieranie L-VGCC prowadzi do przeciążenia wapniem, co jest cechą charakterystyczną starzenia się neuronów.

Wiązanie wapnia ze wskaźnikiem generuje fluorescencję, przy czym starzejące się neurony wykazują wyższą intensywność fluorescencji, odzwierciedlając zwiększony wewnątrzkomórkowy poziom wapnia po stymulacji.

W tej procedurze inkubuj komórki z Fura2-AM przez 60 minut w temperaturze pokojowej w ciemności