JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:41 min. • May 29th, 2025
Weźmy krótkoterminową hodowlę neuronów hipokampa szczura reprezentującą młode neurony i długoterminową hodowlę reprezentującą starzejące się neurony.
Starzejące się neurony wykazują większą gęstość kanałów wapniowych bramkowanych napięciem typu L lub L-VGCC, które pozostają otwarte przez dłuższy czas po depolaryzacji błony.
Inkubuj z fluorescencyjnym wskaźnikiem wapnia, który dyfunduje do komórek, a następnie umyj, aby usunąć nadmiar barwnika.
Umieść kultury w komorze perfuzyjnej pod mikroskopem fluorescencyjnym.
Wprowadź roztwór zawierający neuroprzekaźniki, które wiążą się z receptorami na neuronach, indukując napływ jonów sodu i wywołując depolaryzację błony.
Depolaryzacja aktywuje L-VGCC, umożliwiając napływ wapnia do cytoplazmy.
W hodowli długotrwałej większa gęstość i przedłużone otwieranie L-VGCC prowadzi do przeciążenia wapniem, co jest cechą charakterystyczną starzenia się neuronów.
Wiązanie wapnia ze wskaźnikiem generuje fluorescencję, przy czym starzejące się neurony wykazują wyższą intensywność fluorescencji, odzwierciedlając zwiększony wewnątrzkomórkowy poziom wapnia po stymulacji.
W tej procedurze inkubuj komórki z Fura2-AM przez 60 minut w temperaturze pokojowej w ciemności, a następnie przenieś szkiełka nakrywkowe do komory perfuzyjnej. Następnie umieść komorę perfuzyjną ze szkiełkiem nakrywkowym w uchwycie na odwróconym mikroskopie. Wybierz pole mikroskopijne i perfuzuj komórki w sposób ciągły za pomocą wstępnie podgrzanego HBS.
Następnie oświetlaj komórki epi na 340 i 380 nanometrach, a następnie rejestruj światło emitowane na 520 nanometrach co 5 do 10 sekund za pomocą kamery fluorescencyjnej, która jest filtrowana przez dichroiczne lustro Fura-2. Do analizy zarejestrowanych obrazów fluorescencyjnych. Najpierw otwórz plik eksperymentu.
Korzystając z oprogramowania AquaCosmos, kliknij Ratio i wybierz żądany zakres proporcji. Oblicz stosunek piksel po pikselu na wynikowych obrazach, aby uzyskać sekwencję obrazów o proporcjach. Następnie odejmij tło, dostosowując przycisk podświetlenia tła. Następnie naciśnij Rozpocznij obliczenia. następnie naciśnij przycisk Sekwencja wszech czasów i usuń starożytne ROI.
W celu analizy ilościowej poszczególnych komórek ustal nowe ROI lub ROI odpowiadające poszczególnym neuronom. Aby narysować wykres poszczególnych nagrań, wyeksportuj wartości fluorescencji współczynnika odpowiadające każdemu zwrotowi z inwestycji do programu laboratorium pochodzenia, klikając przycisk Wykres. Następnie kliknij Oblicz i zapisz plik TXT. Następnie wykonaj odpowiednie obliczenia, aby oszacować wielkość wzrostu współczynnika fluorescencji w odpowiedzi na każdą stymulację.