JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:14 min • May 29th, 2025
Zacznij od wycinków mózgu z neurodegeneracyjnego modelu myszy.
Inkubuj z dodatkiem detergentu roztworu blokującego, aby zwiększyć przepuszczalność tkanek i zablokować niespecyficzne wiązanie. Wyrzuć roztwór.
Wprowadzić przeciwciała pierwszorzędowe skierowane przeciwko blaszkom beta-amyloidu. Inkubować z mieszaniem, aby przeciwciała oddziaływały z blaszkami beta-amyloidu, a następnie umyć.
Dodaj przeciwciała drugorzędowe znakowane czerwonym fluoroforem i inkubuj w ciemności, aby umożliwić interakcję przeciwciał.
Przemyć w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał, a następnie przepłukać alkoholem.
Dodaj kurkuminę, która wiąże amyloidy bogate w beta-arkusze z wysokim powinowactwem, a następnie umyj.
Następnie potraktuj zwiększonym stężeniem alkoholu, odwadniając sekcje mózgu. Dodaj ksylen, aby usunąć wszelkie ślady odczynników.
Zamontuj wycinek na szkiełku i obserwuj pod mikroskopem fluorescencyjnym.
Użyj lasera o długości fali 590 nm, aby wzbudzić czerwone fluorofory na przeciwciałach drugorzędowych. Uchwyć obraz.
Przełącz się na laser o długości fali 480 nm, aby wzbudzić kurkuminę, emitując zieloną fluorescencję.
Nałóż obrazy; kolokalizacja czerwonej i zielonej fluorescencji potwierdza płytkę beta-amyloidową w tkance mózgowej.
W celu znakowania próbek wyciętych w kriostat przeciwciałami anty-A beta, należy przemyć próbki trzykrotnie świeżym PBS na przemycie w indywidualnych dołkach 12-dołkowej płytki przed zablokowaniem niespecyficznego wiązania 10% normalnej surowicy koziej w PBS i 0,5% Triton x-100 przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.
Pod koniec inkubacji odrzucić roztwór blokujący i inkubować próbki z przeciwciałem swoistym dla A beta przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza i 150 obrotach na minutę. Następnego ranka przemyć skrawki trzema 10-minutowymi płukaniami w świeżym PBS na przemycie, a następnie inkubować z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z czerwonym fluoroforem przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem.
Pod koniec inkubacji przemyć skrawki trzykrotnie PBS, a następnie raz przemyć 70% alkoholem. Po przemyciu alkoholem inkubować skrawki z 10 mikromolową kurkuminą przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie trzy minuty płukanie 70% alkoholem.
Po ostatnim myciu odwodnić sekcje 90% i 100% alkoholem przez jedną minutę na stężenie i czyścić sekcje dwa razy przez pięć minut na zanurzenie świeżym ksylenem na inkubację. Następnie zamontuj i zobrazuj sekcje, jak pokazano.