Trójwymiarowa wizualizacja zakażenia wirusem wścieklizny w tkance mózgowej myszy

Weź stały gruby wycinek mózgu od myszy zarażonej wirusem wścieklizny.

Wirus infekuje neurony i replikuje się, w wyniku czego białka wirusowe są obecne w komórkach.

Traktuj detergentem, aby przeniknąć przez błony komórkowe i roztworem blokującym, aby zamaskować niespecyficzne miejsca wiązania.

Inkubować z pierwszorzędowymi przeciwciałami skierowanymi przeciwko białkom wirusa, a następnie z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem, które wiążą się z przeciwciałami pierwszorzędowymi.

Potraktuj fluorescencyjnym barwnikiem wiążącym kwasy nukleinowe, aby oznaczyć jądro.

Odwodnić tkankę w rosnącym stężeniu alkoholu, a następnie zastosować roztwór oczyszczający, aby zwiększyć przezroczystość tkanki do obrazowania.

Zamontuj sekcję w komorze obrazowania, napełnij ją roztworem czyszczącym i zamknij.

Za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej zobrazuj tkankę oddzielnie za pomocą etykiet fluorescencyjnych, a następnie połącz je, aby utworzyć dwuwymiarowy obraz.

Uzyskuj obrazy w różnych płaszczyznach ogniskowych w tkance i łącz je, aby wygenerować trójwymiarową reprezentację do oceny postępu infekcji.

W celu barwienia immunologicznego skrawków tkanki mózgowej należy myć próbki dwa razy przez 1 godzinę w 4 mililitrach 0,2% Triton X-100 w PBS, a następnie przez dwa dni permeabilizować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, w 4 mililitrach 0,2% Triton X-100, 20% dimetylosulfotlenku i 0,3 molowej glicyny w PBS. Zablokuj wszelkie niespecyficzne wiązania za pomocą 4 mililitrów 0,2% Triton X-100, 10% dimetylosulfotlenku i 6% normalnej surowicy w PBS przez dwa dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji blokującej oznaczyć próbki 2 mililitrami roztworu przeciwciała pierwszorzędowego przez pięć dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza, odświeżając roztwór przeciwciała po dwóch i pół dniach. Następnie myj próbki przez jeden dzień w 4 mililitrach 0,2% Tween 20 i 10 mikrogramów na mililitr heparyny w PBS, wymieniając bufor do przemywania co najmniej cztery do pięciu razy w ciągu dnia i pozostawiając końcowe płukanie na noc.

Następnego dnia inkubuj próbki w 2 mililitrach roztworu przeciwciał drugorzędowych przez pięć dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie umyj próbki w 4 mililitrach świeżej 0,2% heparyny Tween 20 i 10 mikrogramów na mililitr w PBS, jak pokazano.

W celu barwienia jądrowego próbek należy inkubować próbki w 4 mililitrach barwnika kwasem nukleinowym TO-PRO-3 przez 5 godzin, chroniąc przed światłem. Pod koniec inkubacji przemyć próbki w 0,2% Tween 20 i 10 mikrogramach na mililitr heparyny w PBS, jak pokazano, a następnie odwodnić w rosnącej serii tert-butanolu przez 2 godziny na zanurzenie.

Po 90% zanurzeniu przenieś próbki na noc do 96% roztworu tert-butanolu. Następnego ranka należy dalej odwadniać próbki w 100% tert-butanolu przez 2 godziny, a następnie oczyścić skrawki tkanek w świeżo przygotowanym BABB-D15 przez 2 do 6 godzin, aż staną się optycznie przezroczyste. Próbki mogą być następnie przechowywane w BABB-D15, chronione przed światłem do czasu ich zamontowania i zobrazowania.

Do montażu próbki użyj drukarki 3D, aby wydrukować komorę obrazowania i pokrywę. Zamontuj szkiełko nakrywkowe o średnicy 30 milimetrów na komorze obrazowania z jednoskładnikową gumą silikonową wulkanizującą w temperaturze pokojowej. Podobnie zamontuj 22-milimetrowe szkiełko nakrywkowe na pokrywie. Użyj bawełnianego wacika zwilżonego wodą, aby usunąć nadmiar gumy silikonowej z obu pierścieni, zanim pozwolisz gumie utwardzić się przez noc.

Następnego dnia umieść próbkę w komorze obrazowania i dodaj niewielką objętość BABB-D15 do komory przed włożeniem pokrywy. Za pomocą igły podskórnej napełnij komorę BABB-D15 przez wlot i zatkaj wlot przed uszczelnieniem komory obrazowania gumą silikonową.

Aby skonfigurować akwizycję obrazu, wybierz odpowiednie linie laserowe dla używanych fluoroforów i dostosuj zakresy wykrywania każdego detektora, aby zapobiec nakładaniu się sygnału między kanałami. Następnie ustaw parametry akwizycji, zdefiniuj górną i dolną granicę stosu i uzyskaj stos obrazów.

Aby wygenerować projekcje 3D stosu obrazów, otwórz pliki obrazów w Fidżi i wybierz Obraz, Kolor, Kanały, narzędzie Więcej i Podziel kanały, aby podzielić scalone obrazy na poszczególne kanały. Aby uzyskać korekcję wybielania obrazów dla każdego kanału, wybierz Obraz, Dostosuj, Korekcja wybielania i wybierz Proste proporcje. Użyj suwaków, aby dostosować jasność i kontrast dla każdego kanału, a następnie wybierz opcję Obraz, Kolor i Scal kanały. Zaznacz opcję Utwórz kompozyt.

Przekonwertuj obraz na format RGB i wybierz opcję Obraz, stosy i projekt 3D, aby wygenerować projekcję 3D. Wybierz najjaśniejszy punkt jako metodę projekcji i ustaw odstępy między plasterkami tak, aby odpowiadały rozmiarowi kroku Z uzyskanego stosu obrazów. Aby uzyskać maksymalną jakość, ustaw przyrost kąta obrotu na 1 i włącz interpolację. W razie potrzeby zmodyfikuj Całkowity obrót, Progi przezroczystości i Krycie. Następnie zapisz projekcję 3D jako oba . Formaty plików TIFF i .AVI.