Obrazowanie histochemiczne modułów korowych w spłaszczonych wycinkach mózgu

Zacznij od wstępnie ustalonych stycznych odcinków spłaszczonych odcinków kory mózgowej. Umyć, aby usunąć ślady utrwalające.

Zabarwić skrawki roztworem diaminobenzydyny lub DAB i siarczanu niklowo-amonowego.

DAB dyfunduje do neuronów korowych i reaguje z oksydazą cytochromową w mitochondriach, tworząc ciemny osad. Siarczan niklowo-amonowy przyciemnia osad, zwiększając kontrast.

Dodaj paraformaldehyd, aby zatrzymać reakcję barwienia, a następnie spłucz.

Zamontuj sekcje na zjeżdżalni i odwodnij je roztworami etanolu.

Spłucz izopropanolem i ksylenem, aby oczyścić sekcję i poprawić przepuszczalność światła.

Nałóż podłoże montażowe i nałóż na nie szkiełko nakrywkowe.

Podczas obrazowania pod mikroskopem jasnego pola, w neuronach korowych, osady pochłaniają i rozpraszają światło, sprawiając, że wydają się ciemne.

W przeciwieństwie do tego, niepoplamione, oczyszczone obszary przepuszczają światło i wydają się jasne.

Ten kontrast uwypukla moduły korowe jako ciemne, niejednolite struktury na jaśniejszym tle, reprezentujące aktywne klastry neuronalne zaangażowane w przetwarzanie informacji sensorycznych.

Płukać tkankę przekroju w buforze HEPES przez 15 minut, delikatnie mieszając. Podczas prania przygotuj świeży roztwór barwiący oksydazę cytochromową i dodaj składnik DAB tuż przed jego użyciem. Teraz inkubuj skrawki w świeżo przygotowanym roztworze barwiącym w temperaturze pokojowej za pomocą shakera. I czuwaj. W zależności od stopnia utrwalenia, barwienie można zaobserwować w ciągu 10 minut lub może to potrwać kilka godzin.

Jeśli reakcja przebiega zbyt wolno, zwiększ temperaturę do 37 stopni Celsjusza. Aby zatrzymać reakcję, przenieś skrawki do kąpieli z 4% PFA i pozwól im inkubować przez 15 minut, delikatnie mieszając. Następnie umyj sekcje trzykrotnie buforem HEPES przez 10 minut na pranie.

Teraz zamontuj i wysusz sekcje na szkiełkach i odwadniaj je za pomocą coraz silniejszych kąpieli etanolowych. Następnie myj szkiełka w izopropanolu przez 5 minut, a następnie ksylenem przez pięć minut. Po kąpieli ksylenowej należy natychmiast dodać szybkoutwardzalne podłoże montażowe na bazie wody. Podłoża na bazie wody zdegradują plamę. Po dodaniu szkiełka nakrywkowego przechowuj szkiełka w temperaturze 4 stopni Celsjusza do momentu zobrazowania.