Analiza komórek odpornościowych w tkankach nerwowych myszy za pomocą cytometrii przepływowej

Weź komórki wyizolowane z nerwów kulszowych myszy i zwojów korzenia grzbietowego lub DRG.

Inkubuj z przeciwciałami znakowanymi fluoroforem przeciwko CD45 i CD11b oraz z przeciwciałami znakowanymi biotyną przeciwko MHC klasy II, aby oznaczyć komórki odpornościowe.

Inkubować ze streptawidyną znakowaną fluoroforem, która wiąże się z biotyną.

Leczyć utrwalaczem, aby ustabilizować strukturę komórkową.

Wprowadź bufor przepuszczalny z fluorescencyjnym barwnikiem DNA, aby przeniknąć błony i oznaczyć jądra.

Za pomocą cytometru przepływowego przepuść komórki przez wiązkę laserową, aby ocenić charakterystykę optyczną i fluorescencyjną.

Usuń agregaty o wyższej fluorescencji DNA, aby wyizolować pojedyncze komórki i wykryć fluorescencję z markerów.

Zidentyfikuj komórki wykazujące ekspresję CD45, charakterystycznego markera komórek odpornościowych, potwierdzając ich obecność.

Większość komórek CD45-dodatnich w DRG wykazuje ekspresję CD11b i MHC klasy II, co wskazuje na komórki podobne do mikrogleju, których nie ma w nerwach kulszowych.

Technika ta uzupełnia obrazowanie do analizy heterogeniczności komórek odpornościowych w tkankach nerwowych.

W komputerze wybierz odpowiednie kanały do wykrywania interesujących nas fluoroforów, odpowiednie natężenie przepływu dla próbek oraz całkowitą liczbę zdarzeń, które mają być zebrane na próbkę. Minimalna liczba wydarzeń powinna wynosić 1 milion

.

Następnie utwórz wykresy punktowe w globalnym arkuszu rozrzutu bocznego A w stosunku do rozproszenia do przodu A, a także dla każdego interesującego nas fluoroforu w stosunku do rozproszenia do przodu A. Utwórz również widok statystyczny, który będzie wyświetlał liczbę zdarzeń i średnią intensywność fluorescencji dla wybranych fluoroforów.

Określ bramkę nadrzędną P1 na podstawie wykresu punktowego z kontrolek barwienia tylko DAPI. Dołącz próbkę do cytometrii przepływowej i kliknij przycisk Pobierz. Obserwuj wykres DAPI w stosunku do FSC i zmniejsz napięcie kanału DNA Pacific Blue, aż populacja DAPI-plus stanie się widoczna. Korzystając z narzędzia do bramkowania prostokąta, narysuj ramkę wokół populacji DAPI-plus. Reprezentuje to bramkę P1. Wybierz wykresy punktowe dla każdego z fluoroforów i wyświetl tylko zdarzenia DAPI-plus. Reprezentuje to fluorescencję tła dla każdego z fluoroforów.

Korzystając z narzędzia do bramkowania prostokątów, narysuj ramkę na wykresach punktowych dla każdego z fluoroforów, zaczynając od 103 na osi y. Ta bramka reprezentuje region, w którym powinny znajdować się pozytywne zdarzenia dla każdego z podanych znaczników. Dostosuj napięcie dla każdego z fluoroforów za pomocą elementów sterujących barwieniem tylko DAPI. Dołącz próbkę do cytometrii przepływowej i kliknij przycisk Pobierz.

Obserwuj położenie populacji DAPI-plus dla każdego z fluoroforów i dostosuj odpowiednie napięcia tak, aby populacje wypadały poza bramkę prostokątną. Po skonfigurowaniu cytometru przepływowego uruchom próbki i wyeksportuj pliki rozproszenia do przodu w celu dalszej analizy.