Obrazowanie podwójnej fluorescencji w celu identyfikacji zróżnicowanych oligodendrocytów

Weźmy hodowlę komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC), wyizolowanych z mózgu młodego szczura, które zostały indukowane do różnicowania się w oligodendrocyty. Komórki są utrwalone w celu zachowania architektury komórkowej.

Zróżnicowane oligodendrocyty wyrażają zasadowe białko mieliny lub MBP, marker dojrzałych oligodendrocytów, podczas gdy zarówno OPC, jak i zróżnicowane komórki wyrażają czynnik transkrypcyjny oligodendrocytów 2 lub Olig2.

Zastosuj roztwór blokujący przepuszczalność i inkubuj z mieszaniem, przepuszczalnie przenikając błony komórkowe i blokując niespecyficzne miejsca wiązania.

Dodać przeciwciała pierwszorzędowe skierowane do markerów i inkubować z mieszaniem, aby umożliwić wiązanie.

Przemyć w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał, a następnie dodać różne przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforem specyficzne dla przeciwciał pierwszorzędowych i inkubować z mieszaniem.

Umyj komórki, a następnie umieść je w systemie obrazowania z podwójną fluorescencją.

Użyj światła o określonych długościach fal, aby wzbudzić wyraźne fluorofory i wykryć emitowane sygnały, aby uwidocznić markery.

Zidentyfikuj zróżnicowane oligodendrocyty eksprymujące olig2 i MBP wśród niezróżnicowanych OPC eksprymujących tylko olig2.

Doprowadź talerz do temperatury pokojowej. Odessać studzienki i dodać 250 mikrolitrów DPBS zawierającego 5% NGS i 0,1% Triton X-100. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę z delikatnym wytrząsaniem orbitalnym. Przygotować podstawowy roztwór do inkubacji, rozcieńczając mysie przeciwciało monoklonalne anty-MBP i królicze przeciwciało poliklonalne anty-OLIG2 w DPBS zawierającym 5% NGS. Następnie inkubuj pierwotne przeciwciała w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc przez 16 do 18 godzin z delikatnym wstrząsaniem orbitalnym.

Podczas mycia płytki należy przygotować wtórny roztwór inkubacyjny, rozcieńczając przeciwciała anty-mysie 680 i anty-królicze 800 w DPBS zawierającym 5% NGS. Następnie odessać końcowe płukanie i dodać 250 mikrolitrów wtórnego roztworu inkubacyjnego. Chronić płytkę przed światłem i inkubować ją w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę z delikatnym potrząsaniem orbitalnym.

Następnie zeskanuj płytkę za pomocą systemu obrazowania zdolnego do wykrywania emisji fluorescencji w 700 i 800 nanometrach. Jako punkt wyjścia ustaw przesunięcie ogniskowej na 3, a czułość na 1,5 dla MBP, 5,0 dla aktyny i 3,5 dla OLIG2. Dostosuj wartości czułości zgodnie z potrzebami, aby uniknąć prześwietlenia sygnału.