Pomiar ekspresji białek w mózgu gryzoni za pomocą fluorescencji w bliskiej podczerwieni i skanowania w wysokiej rozdzielczości

Weź szklane szkiełko zawierające skrawki tkanki mózgowej szczura barwione immunologicznie na obecność receptorów AMPA i NMDA w neuronach ciała migdałowatego.

Receptory AMPA pośredniczą w indukowanym glutaminianem napływie sodu i szybkiej pobudzającej transmisji synaptycznej.

W przeciwieństwie do tego, receptory NMDA pośredniczą w indukowanym glutaminianem i koagonistą napływie sodu i wapnia, ułatwiając powolną pobudzającą transmisję synaptyczną.

Receptory są barwione przeciwciałami pierwszorzędowymi i wykrywane za pomocą przeciwciał drugorzędowych znakowanych fluoroforem w bliskiej podczerwieni.

Umieść szkiełko stroną tkankową do dołu na interfejsie skanowania w bliskiej podczerwieni.

Dostosuj parametry obrazowania i rozpocznij obrazowanie.

Po oświetleniu laserowym fluorofory na receptorach AMPA i NMDA emitują fluorescencję.

Obrazowanie w bliskiej podczerwieni minimalizuje autofluorescencję, poprawiając klarowność sygnału.

Skanowanie w wysokiej rozdzielczości zapewnia ponadto wyraźne różnicowanie sygnałów fluorescencyjnych, umożliwiając precyzyjną wizualizację pobliskich receptorów AMPA i NMDA w ciele migdałowatym.

Korzystając z oprogramowania do obrazowania, oblicz współczynnik intensywności fluorescencji AMPA/NMDA w określonym obszarze zainteresowania jako marker uczenia się i pamięci.

Umieść szkiełka na interfejsie skanowania w bliskiej podczerwieni z tkanką skierowaną w dół. Obrazowanie wielu slajdów jednocześnie za pomocą narzędzia do zaznaczania. Zobrazuj slajdy przy użyciu najwyższych ustawień jakości, z rozdzielczością 21 mikrometrów. Z przesunięciem 0 nanometrów zaimportuj obrazy do oprogramowania do analizy obrazu, aby wyświetlić i oznaczyć do półilościowej analizy białek.

Po otwarciu oprogramowania do analizy obrazu wybierz obszar roboczy, do którego obraz został zeskanowany. Następnie otwórz zeskanowany obraz w oprogramowaniu do analizy obrazu, aby wyświetlić skan i dostosować długości fal, kontrast, jasność i powiększenie wyświetlane bez zmiany surowego obrazu lub całkowitej emisji ilościowej.

Po zidentyfikowaniu kluczowych regionów do oceny ilościowej wybierz kartę Analiza u góry strony, a następnie wybierz opcję Rysuj prostokąt, aby narysować prostokąt nad obszarem, który zostanie określony ilościowo. Aby wyświetlić rozmiar prostokąta, wybierz pozycję Kształty w lewym dolnym rogu ekranu. Następnie wybierz pozycję Kolumny w prawym dolnym rogu. Następnie dodaj kolumny Wysokość i Szerokość, aby zidentyfikować rozmiar kształtu. Na koniec nazwij kształt i powtórz. Po próbkowaniu wszystkich regionów kontynuuj łączenie i analizowanie danych dostępnych na karcie Kolumny.