Obrazowanie fotoaktywacji fluorescencyjnej transportu neurofilamentów w mielinizowanych aksonach myszy

Zacznij od zestawu perfuzyjnego umieszczonego na stoliku mikroskopu odwróconego.

Zespół perfuzyjny zawiera wypreparowany nerw obwodowy zabezpieczony między szkiełkiem nakrywkowym a zjeżdżalnią mikroakweduktu z ciągłą perfuzją soli fizjologicznej.

Mielinizowane aksony nerwu wyrażają zielone neurofilamenty znakowane fluoroforem.

Korzystając z oświetlenia jasnego pola, skup się na mielinizowanych aksonach.

Przełącz się na tryb konfokalny, fotowybielacz z dużą mocą lasera, a następnie uchwyć obraz referencyjny o niskiej autofluorescencji przy użyciu niskiej mocy lasera.

Narysuj równoległe linie wzdłuż aksonu, aby określić długość okna fotoaktywacji. Użyj tego jako przewodnika, aby utworzyć prostokątny obszar aktywacji.

Oświetl ten obszar określoną długością fali, aby aktywować zielone neurofilamenty oznaczone fluoroforem, powodując ich fluorescencję. Uzyskaj obraz.

Po aktywacji uchwyć zdjęcia poklatkowe.

Z biegiem czasu fluorescencyjne neurofilamenty poruszają się w obu kierunkach i rozprzestrzeniają się na sąsiednie obszary.

Pojawienie się fluorescencji w obszarach flankujących przylegających do obszaru aktywacji potwierdza transport neurofilamentów.

Chwyć bliższy koniec nerwu i powoli połóż go na szkiełku nakrywkowym. Następnie wyprostuj go pod delikatnym napięciem. Umieść zjeżdżalnię mikroakweduktu nad nerwem z rowkowaną zjeżdżalnią w dół i ustaw kierunek przepływu równolegle do nerwu. Odwróć szkiełko nakrywkowe i zespół mikroakweduktu i umieść go w obudowie komory perfuzyjnej tak, aby suwak był przeciwny do uszczelki zewnętrznej.

Aby zabezpieczyć komorę perfuzyjną, umieść ją w metalowej obudowie i obróć pierścień blokujący. Powoli wciśnij tłok strzykawki z solą fizjologiczną i napełnij komorę perfuzyjną. Rurki wlotowe i wylotowe, kolba wylotowa i strzykawka powinny być uniesione nad samą komorą przez cały czas podczas konfiguracji i obrazowania. Przenieś zestaw perfuzyjny do odwróconego stolika mikroskopowego i zamontuj strzykawkę z solą fizjologiczną w pompie strzykawkowej. Następnie uruchom silnik i dostosuj prędkość do natężenia przepływu 0,25 mililitra na minutę.

Podłącz wbudowany podgrzewacz roztworu i ustaw go na 37 stopni Celsjusza. Podłącz grzejnik obiektywowy i ustaw go na 37 stopni Celsjusza. Nałóż olej na obiektyw i włóż komorę perfuzyjną do mocowania stage. Nałóż olej na podkładkę grzewczą komory i przymocuj ją do komory perfuzyjnej. Następnie podłącz go i ustaw na 37 stopni Celsjusza.

Zablokuj komorę perfuzyjną w stage adapter i doprowadź olej do obiektywu do kontaktu ze szkiełkiem nakrywkowym na spodzie komory. Użyj oświetlenia w jasnym polu, aby skupić się na warstwie aksonów na dolnej powierzchni nerwu znajdującej się najbliżej powierzchni szkiełka nakrywkowego. Zmielinizowane aksony można zidentyfikować po obecności osłonki mielinowej, która jest widoczna w świetle przechodzącym w jasnym polu bez wzmocnienia kontrastu.

Uzyskaj obraz referencyjny w jasnym polu, rejestrując kierunkowość nerwu. Następnie uzyskaj obraz konfokalny za pomocą lasera o długości fali 488 nanometrów i filtra emisyjnego odpowiedniego dla fotoaktywowanego GFP. Ustaw moc lasera na około pięciokrotność normalnej mocy obrazowania i uzyskaj obraz z czasem naświetlania od trzech do czterech minut. Następnie uzyskaj kolejny obraz konfokalny, aby zarejestrować autofluorescencję przed aktywacją po etapie wybielania.

Narysuj linię równoległą do aksonów o długości równej żądanemu rozmiarowi okna aktywacji obrazu w jasnym polu. Używając tej linii jako przewodnika, narysuj prostokątny obszar zainteresowania w poprzek pola widzenia prostopadłego do aksonów. Aktywuj fluorescencję GFP w tym regionie poprzez wzbudzenie wzoru światłem o długości 405 nanometrów, upewniając się, że obraz jest uzyskiwany tuż przed i bezpośrednio po aktywacji. Po zakończeniu aktywacji uruchom jednominutowy minutnik. Kiedy się wyłączy, rozpocznij pobieranie serii poklatkowej.