JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:54 min. • May 29th, 2025
Zabezpiecz unieruchomioną transgeniczną Drosophilę z głową wystawioną w komorze rejestracyjnej na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego.
Ciało grzyba muchy składa się z neuronów wyrażających wrażliwe na wapń bioluminescencyjne białko fuzyjne, które jest aktywowane przez wstępnie załadowany kofaktor.
Podłącz rurkę perfuzyjną do komory. Zlokalizuj fluorescencyjne ciała grzybów, skupiając się na kielichu i płatach przyśrodkowych. Potwierdź drenaż za pomocą bufora. Ustaw
parametry obrazowania i skup się na kielichu i płatach przyśrodkowych. W ciemności należy uzyskać podstawowe obrazy fluorescencyjne ciał grzybów przed ekspozycją na stymulant.
Perfuzja nikotyny w buforze zawierającym wapń w celu aktywacji nikotynowych receptorów acetylocholiny, wyzwalając napływ wapnia i emisję światła bioluminescencyjnego.
Przemyć buforem, aby przywrócić warunki wyjściowe
.Perfuzja chlorku potasu w celu depolaryzacji neuronów, wyzwalając wewnątrzkomórkowe uwalnianie wapnia i emisję sygnału bioluminescencyjnego.
Przemyć buforem, aby przywrócić warunki wyjściowe
.Analizuj obrazy, aby ocenić przestrzenną i czasową aktywność wapnia w kielichu i płatach przyśrodkowych.
- Następnie umieść próbkę na uchwycie pod mikroskopem i ustaw powiększenie na 5x. Następnie włóż rurkę perfuzyjną do kanału przez nakłucie. Ustaw mikroskop w trybie fluorescencyjnym, a następnie wyśrodkuj i ustaw ostrość ciał grzybów. Gdy ciała grzybów są już ostre, zmień powiększenie na 20x. Wyśrodkuj obraz i dostosuj ostrość.
Następnie umieść urządzenie drenażowe nad basenem drenażowym i wyreguluj wysokość bocznika drenażowego tak, aby końcówka znajdowała się tuż nad basenem drenażowym. Następnie przepłukać próbkę roztworem Ringera przez 30 sekund, aby sprawdzić, czy drenaż jest odpowiedni. Na koniec pociągnij osłonę w dół, aby uszczelnić urządzenie przed światłem zewnętrznym
.Korzystając z automatycznego systemu w programie Photon Imager, dokonaj precyzyjnych korekt ostrości i wykonaj referencyjne zdjęcie fluorescencyjne ciał grzybów. Dostosuj położenie pól obszaru zainteresowania nad kielichem, ciałami komórek i płatami przyśrodkowymi, klikając pola i przeciągając je na miejsce, przytrzymując Control.
Teraz zapisuj wartości bazowe przez około 5 do 10 minut. Następnie włącz przełącznik, aby rozpocząć przepływ nikotyny. W tym samym czasie naciśnij Enter i dodaj notatkę oznaczającą, że rozpoczął się przepływ nikotyny. Po jednej minucie zatrzymaj przepływ i dokonaj kolejnej notatki w dzienniku, co oznacza, że przepływ został zatrzymany. Następnie przemyj próbkę roztworem Ringera przez pięć minut.
Gdy próbka dojdzie do siebie, wyłącz pranie, ustaw minutnik na dodatkowe pięć minut i przygotuj się do rozpoczęcia przepływu chlorku potasu. Gdy wszystko będzie gotowe do rozpoczęcia, rozpocznij przepływ chlorku potasu i wprowadź 100-milimolowy start chlorku potasu do dziennika próbki. Po upływie jednej minuty zatrzymać przepływ i wprowadzić chlorek potasu odcięty do dziennika próbki. Następnie przemyj próbkę roztworem Ringera przez jedną minutę i przełącz mikroskop w tryb fluorescencyjny. Wykonaj końcowe zdjęcie fluorescencyjne, a następnie wyłącz roztwór Ringera i usuń próbkę.