Mikroskopia dwufotonowa do obrazowania in vivo mikrokrążenia mózgu myszy

Zacznij od znieczulonej myszy z płytką na głowę przymocowaną do chirurgicznie przygotowanego okna korowego z cienkiej czaszki.

Ustaw mysz na wznak. Usuń przyśrodkową skórę uda, aby odsłonić żyłę udową.

Wstrzyknij koniugat barwnika fluorescencyjnego do żyły, aby oznaczyć osocze krwi, umożliwiając wizualizację naczyń krwionośnych.

Zszyj nacięcie.

Odwróć mysz i zabezpiecz nagłówek w uprzęży, aby ustabilizować mysz.

Przenieś zestaw do stolika mikroskopu dwufotonowego.

Dodaj sól fizjologiczną przez okienko korowe. Opuść soczewkę obiektywu, aż zetknie się z solą fizjologiczną.

Korzystając z oświetlenia w jasnym polu, zlokalizuj obszar obrazowania.

Przełącz się na obrazowanie dwufotonowe.

Laser mikroskopu skupia niskoenergetyczne światło w bliskiej podczerwieni w mózgu.

W ognisku lasera dwa fotony łączą swoją energię, aby wzbudzić barwnik, powodując fluoryzację naczyń krwionośnych.

Zidentyfikuj łożysko naczyń włosowatych - sieć małych naczyń krwionośnych łączących tętnice z żyłami - i powiększ je.

Zdobądź obrazy, aby przeanalizować mikrokrążenie mózgu.

W tej procedurze usuń skórę na przyśrodkowym lewym udzie myszy. Następnie zlokalizuj żyłę udową. Za pomocą 1-mililitrowej strzykawki i igły o rozmiarze 30 pobrać 130 mikrolitrów roztworu barwnika fluorescencyjnego. Powoli wstrzyknij 100 mikrolitrów barwnika do żyły udowej.

Po wyjęciu igły należy wywierać stały, delikatny nacisk na miejsce wstrzyknięcia, aby zatrzymać krwawienie i pozwolić barwnikowi krążyć przez pięć minut. Następnie zamknij miejsce operacyjne szwami. Ostrożnie przełóż mysz na brzuch i umieść ją w uprzęży płyty głowy myszy. W przypadku obrazowania dwufotonowego in vivo należy przenieść aparat chirurgiczny do mikroskopu dwufotonowego i upewnić się, że poziom znieczulenia zwierzęcia jest

utrzymany.

Następnie umieść niewielką ilość 0,9% soli fizjologicznej w zbiorniku na płycie głowicy i opuść obiektyw mikroskopu tak, aby zetknął się z solą fizjologiczną. Następnie zlokalizuj obszar zainteresowania, używając obiektywu do oglądania w jasnym polu. Następnie rozpocznij obrazowanie dwufotonowe. Zlokalizuj złoże kapilarne na ekranie widoku i powiększ ten obszar za pomocą zoomu optycznego 2. Uzyskaj obrazy naczyń włosowatych za pomocą oprogramowania do obrazowania dwufotonowego.