JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 1:56 min • June 17th, 2025
Weźmy pokrytą polimerem płytkę wielodołkową zawierającą embrionalne pierwotne komórki kory mózgowej myszy, takie jak komórki progenitorowe i neuronalne. Komórki progenitorowe są transfekowane w celu ekspresji białek fluorescencyjnych w celu znakowania i śledzenia.
Przenieś płytkę do wstępnie podgrzanej komory inkubacyjnej odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, aby uzyskać stabilne środowisko obrazowania.
Zlokalizuj pozycję odniesienia na płycie, aby uzyskać spójne lokalizacje obrazowania.
Wybierz wiele pól obrazowania na studzienkę przy większym powiększeniu, aby zmaksymalizować prawdopodobieństwo obserwacji transfekowanych komórek.
W regularnych odstępach czasu jednocześnie rejestruj obrazy z kontrastem fazowym, aby ujawnić morfologię i dynamikę komórek, oraz obrazy fluorescencyjne, aby monitorować ekspresję białek fluorescencyjnych.
Porównuj obrazy poklatkowe, kontrast fazowy i obrazy fluorescencyjne, aby śledzić podział i różnicowanie komórek progenitorowych w linie neuronalne.
Aby zobrazować komórki transdukowane retrowirusem, umieść płytkę kultury tkankowej w komorze obrazowania podłączonej do kontrolerów temperatury i dwutlenku węgla, aby utrzymać komórki w stałych warunkach 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.
Wybierz pozycję na osi XY, która ma służyć jako punkt zerowy, a następnie skalibruj punkt zerowy. Wybierz od 10 do 15 pozycji na dołek, które mają być obrazowane w 10-krotnym powiększeniu. Ustaw oprogramowanie tak, aby rejestrowało obrazy kontrastu fazowego co pięć minut, a obrazy fluorescencyjne co trzy godziny, aby zmniejszyć fototoksyczność. Sprawdź i dostosuj ostrość w ciągu pierwszych trzech godzin eksperymentu, ponieważ może się ona zmienić, gdy temperatura się równoważy.