Mikroendoskopowe obrazowanie wapnia w czasie rzeczywistym u swobodnie poruszającej się myszy

Zacznij od znieczulonej myszy zabezpieczonej w mobilnym systemie klatek.

Mysz ma wstępnie wszczepioną soczewkę gradientowego współczynnika załamania światła skierowaną do ciała migdałowatego mózgu, gdzie neurony wyrażają wrażliwe na wapń białko fluorescencyjne.

Powierzchnia soczewki jest pokryta w celu ochrony.

Pozwól myszy się obudzić, a następnie zastosuj przepływ powietrza, aby obracać klatkę bez tarcia.

Zdejmij osłonę obiektywu i umieść zminiaturyzowany mikroskop nad mózgiem.

Włącz diodę LED mikroskopu. Następnie ustaw mikroskop tak, aby obiektyw był wyśrodkowany w polu view.

Uchwyć obraz obiektywu i dostosuj położenie mikroskopu.

Gdy klatka się obraca, ruchy nóg myszy generują strach, stymulując neurony ciała migdałowatego.

Powoduje to napływ jonów wapnia, które wiążą się ze wskaźnikami fluorescencyjnymi.

Światło LED wzbudza te wskaźniki związane z wapniem, powodując ich fluorescencję.

Soczewka o gradientowym współczynniku załamania światła skutecznie wychwytuje i przekazuje tę fluorescencję do mikroskopu.

Umożliwia to obrazowanie aktywności neuronalnej ciała migdałowatego w czasie rzeczywistym.

Aby ocenić jakość implantacji soczewki GRIN, umieść klatkę węglową pod znieczuloną myszą na pałąku pod głową systemu klatek do przyczep kempingowych i włącz przepływ powietrza, aby klatka poruszała się swobodnie bez tarcia. Użyj chwytaka mikroskopu i manipulatora stereotaktycznego, aby ustawić zminiaturyzowany mikroskop w pionie do ramy, a następnie opuść mikroskop, aż powierzchnia wszczepionej soczewki GRIN pojawi się w polu widzenia obrazu w oprogramowaniu. Wyrównaj środek wszczepionej soczewki GRIN ze środkiem pola widzenia i uchwyć obraz powierzchni wszczepionej soczewki GRIN. Następnie powoli podnieś soczewkę obiektywu mikroskopu, obserwując obraz pod kątem pojawienia się komórek wykazujących ekspresję GCaMP.